脂肪干細(xì)胞在皮膚組織工程中的研究應(yīng)用進(jìn)展

肖永強(qiáng)　夏照帆

[摘要]組織工程皮膚作為一種皮膚組織替代物，主要用于覆蓋和修復(fù)損傷缺損的皮膚組織，以改善其形態(tài)和功能。其中，種子細(xì)胞、支架材料及細(xì)胞因子是皮膚組織工程研究的三要素。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有來源豐富、取材方便、低免疫原性、易擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，是皮膚組織工程較為理想的種子細(xì)胞。本文就ADSCs在組織工程皮膚中，包括創(chuàng)面修復(fù)、抑制瘢痕增生等的相關(guān)應(yīng)用研究進(jìn)展及前景進(jìn)行綜述。

[關(guān)鍵詞]脂肪干細(xì)胞；皮膚組織工程；種子細(xì)胞；修復(fù)

[中圖分類號(hào)]R644 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2016）06-0030-04

皮膚作為人體最大的組織器官，覆于體表，起到維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、阻止外界有害物質(zhì)入侵等十分重要的作用。臨床上，自體皮源的缺乏常致大面積燒傷和嚴(yán)重創(chuàng)傷患者創(chuàng)面難以及時(shí)修復(fù)，嚴(yán)重影響機(jī)體的形態(tài)和功能，甚至危及到患者生命。近年來，隨著組織工程技術(shù)及有關(guān)生命科學(xué)的不斷發(fā)展而興起的組織工程皮膚替代物，不僅能夠及時(shí)覆蓋創(chuàng)面，減少體內(nèi)水分及電解質(zhì)的丟失，維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而且還能夠減少創(chuàng)面愈合遠(yuǎn)期瘢痕的增生，改善創(chuàng)面的外觀和患者的身心健康。因此，組織工程化皮膚具有廣闊而深遠(yuǎn)的臨床應(yīng)用前景。

種子細(xì)胞、支架材料及細(xì)胞因子是皮膚組織工程研究的三要素。近年來，有可能作為種子細(xì)胞的干細(xì)胞擁有良好的多分化潛能及細(xì)胞因子分泌功能，己越來越被研究者所重視。干細(xì)胞的主要來源有胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞等，但因胚胎干細(xì)胞有一定的免疫原性、涉及一定的倫理學(xué)問題，骨髓干細(xì)胞（bolle marrow stem cells，BMSCs）來源少、取材時(shí)創(chuàng)傷大，極大地限制了它們的臨床應(yīng)用，脂肪干細(xì)胞（adiposed derived stem cell，ADSCs）具有來源豐富、取材方便、低免疫原性、易擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，成為目前皮膚組織工程較為理想的種子細(xì)胞之一。本文就ADSCs在組織工程皮膚中的相關(guān)應(yīng)用研究進(jìn)展及前景進(jìn)行綜述。

1.ADSCs的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性

1.1ADSCs的分離純化：ADSCs主要來源于人體脂肪組織，其提取及培養(yǎng)步驟相對(duì)較多，在分離的基礎(chǔ)上結(jié)合相應(yīng)的純化方法，便能夠得到純度相對(duì)較高的脂肪干細(xì)胞。

ADSCs分離方法主要沿用了問充質(zhì)干細(xì)胞的分離流程，包括酶消化法及非酶促分離法兩大類。酶消化法的主要原理是通過膠原酶消化細(xì)胞間的膠原組織，使細(xì)胞相互分離，再通過過濾、洗滌和離心等步驟分離獲得脂肪干細(xì)胞，分離速度較快，缺點(diǎn)是膠原酶較為昂貴，而且在酶的種類、所需濃度及作用時(shí)間上缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，需要靠操作者憑借個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)來判斷。非酶促分離法包括組織塊貼壁法、直接離心法、吸附柱法等其中，貼壁法需要解決的主要問題是組織塊貼壁難，換液時(shí)容易漂浮，如果這一問題能夠被有效地解決，其將是一種應(yīng)用前景十分可觀的分離方法；吸附柱法是利用聚乙烯織物等做成的吸附柱裝置對(duì)貼壁細(xì)胞的親和力作用而分離脂肪干細(xì)胞，雖然價(jià)格相對(duì)低廉，但需要樣品量較大。上述的各種ADSCs分離方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此尋找一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉的ADSCs分離方法仍是未來ADSCs研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。

分離后為了得到純度較高的ADSCs，緊接著便是ADSCs純化。目前常用的ADSCs純化方法包括：免疫磁珠分選和密度梯度離心法，由于免疫磁珠分選法涉及到的設(shè)備及抗體均比較昂貴，不適合普通的研究機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用，而密度梯度離心的方法雖然步驟相對(duì)較繁瑣，但成本會(huì)低很多，因此其是相對(duì)較為理想可行的純化方法。

1.2ADSCs的表面標(biāo)志物：雖然目前對(duì)ADSCs免疫表型的鑒定做了大量工作，但ADSCs的表面標(biāo)志物繁雜，尚未發(fā)現(xiàn)特異性的可用于鑒別的表面標(biāo)志物。現(xiàn)普遍認(rèn)為ADSCs表達(dá)CD13、CD71、CD73、CD29、CD90、CD105和CD166等表面抗原標(biāo)志，而不表達(dá)CD11、CD19、CD31、CD33、CD38、CD45等。表達(dá)CD73、CD105和CD90，不表達(dá)CD45，并在體外能夠誘導(dǎo)分化成為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞，是ADSCs作為人類間充質(zhì)干細(xì)胞的最低標(biāo)準(zhǔn)。

1.3ADSCs的多向分化潛能：自2001年首次從人脂肪中成功分離并得以體外培養(yǎng)以來，ADSCs能夠在一定條件下被成功誘導(dǎo)分化為內(nèi)胚層、中胚層及外胚層的眾多細(xì)胞系，如肌肉細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，具有多向分化潛能例如，在一定條件下ADSCs能夠誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，不但能夠表達(dá)產(chǎn)生白蛋白和甲胎蛋白，還擁有吸收低密度脂蛋白LDL、儲(chǔ)存糖原等類似人類肝臟細(xì)胞的功能。而早年Safford等人就分別通過實(shí)驗(yàn)研究證明ADSCs在一定條件下可以誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)元樣細(xì)胞。不僅如此，ADSCs還有神經(jīng)保護(hù)作用，移植到周圍神經(jīng)損傷處的ADSCs可以通過減少小膠質(zhì)細(xì)胞的生成、分泌BDNF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來促進(jìn)軸突生長(zhǎng)起到神經(jīng)保護(hù)作用。此外，在體外增殖許多代的子代脂肪干細(xì)胞仍具有完好的表面標(biāo)志物及較強(qiáng)的分化潛能，表明其作為皮膚組織工程的種子細(xì)胞具有巨大的優(yōu)勢(shì)。

2.ADSCs與皮膚組織工程

2.1ADSCs可以作為皮膚組織工程皮膚的種子細(xì)胞：ADSCs在臨床上易于大量獲得，而且可以自體移植不涉及相關(guān)的倫理問題，作為組織工程的種子細(xì)胞近年來越來越受到研究者的青睞，己被廣泛應(yīng)用到軟骨組織工程、骨組織工程和脂肪組織工程等的研究應(yīng)用當(dāng)中。如前所述，ADSCs在體外誘導(dǎo)下，可成功向上皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞分化。Derby等將ADSCs組織移植到小鼠真皮層后可成功誘導(dǎo)其分化為表皮干細(xì)胞，并表達(dá)表皮干細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志物p63。將ADSCs種植于人脫細(xì)胞真皮上培養(yǎng)，加入表皮生長(zhǎng)因子和高濃度的鈣離子后，ADSCs能夠成功分化成為角質(zhì)形成細(xì)胞，并能夠形成類似于正常皮膚組織的復(fù)層表皮結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)皮膚組織工程中表皮的再生。這些優(yōu)良特性都是其作為皮膚組織工程種子細(xì)胞的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

2.2ADSCs與皮膚組織工程支架材料能夠有機(jī)結(jié)合：理想的組織工程皮膚支架材料應(yīng)該有良好的機(jī)械性能（主要包括機(jī)械強(qiáng)度和伸縮性能）、良好的生物相容性（能夠引導(dǎo)細(xì)胞粘附及生長(zhǎng)，為種子細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖提供適宜的空間）和無毒副作用的降解產(chǎn)物等特點(diǎn)。按照其化學(xué)性質(zhì)的不同，組織工程皮膚支架材料主要可分為天然支架材料和合成支架材料，天然支架材料擁有良好的生物相容性，但生物力學(xué)性能相對(duì)較差，而人工合成支架材料的生物力學(xué)性能優(yōu)于天然支架材料，但往往有一定的細(xì)胞毒性，限制其廣泛應(yīng)用及發(fā)展。目前研究較熱的合成支架材料主要是聚焦內(nèi)酯及聚內(nèi)酯等聚酯類材料，天然生物支架材料主要是膠原類、殼聚糖類及纖維蛋白類等。

研究表明，眾多的皮膚組織工程支架材料能夠與脂肪干細(xì)胞有機(jī)結(jié)合，引導(dǎo)脂肪干細(xì)胞的粘附和增殖，構(gòu)建的復(fù)合皮膚組織局部應(yīng)用能夠很好的促進(jìn)創(chuàng)面愈合，減少瘢痕的增生。如利用靜電紡絲技術(shù)制備的純聚合材料

聚乳酸聚己內(nèi)酯PLCL及PLCL/Poloxamer與大鼠脂肪干細(xì)胞的相容性良好，在微觀結(jié)構(gòu)上能與細(xì)胞外基質(zhì)較一致，非常適合脂肪干細(xì)胞的黏附及增殖，且其柔韌性及機(jī)械性好、抗磨損，是廣泛應(yīng)用于組織工程的支架材料。以3-羥基丁酸-co-3-羥基戊酸共聚物poly（3-hydroxybutyrate-co-3hydroxyvalerate）（PHBV）作為真皮支架，能夠更好地為ADSCs提供良好的力學(xué)支撐及適當(dāng)?shù)奈h(huán)境，保持創(chuàng)面水分的同時(shí)，還擁有足夠的機(jī)械性能以抑制創(chuàng)面的收縮，7d后ADSCs能夠通過分泌VEGF和bFGF而促進(jìn)血管再生，28d后移植的PHBV支架完全降解，隨后在PHBV原位生成的真皮擁有更加復(fù)雜的膠原結(jié)構(gòu)，并能夠通過減少TGF-B 1和a-SMA和增加TGF-B 3的分泌抑制創(chuàng)面瘢痕的增生。

2.3ADSCs能夠分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)組織工程皮膚的重建：各類具有活性的生長(zhǎng)因子為種子細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)節(jié)作用。研究表明，ADSCs擁有強(qiáng)大的分泌能力，能夠分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胎盤生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、血管生成素等眾多生長(zhǎng)因子，這些細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)種子細(xì)胞增殖、遷移、分化及蛋白的表達(dá)、維持其生物學(xué)功能、促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)免疫原性等十分重要的作用，能夠促進(jìn)組織工程皮膚的重建。

3.ADSCs與創(chuàng)面愈合

3.1ADSCs能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合：創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到炎癥反應(yīng)、血管的生成和新生組織的產(chǎn)生和重塑等過程。脂肪源性干細(xì)胞能夠?qū)⒆约汉椭車木植课h(huán)境整合到一起，加速創(chuàng)面修復(fù)并分化成所需要的細(xì)胞，還能通過自分泌及旁分泌的形式分泌EGF、VEGF、vWF、VEGF等眾多細(xì)胞因子，刺激血管再生，減輕創(chuàng)面局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)周圍的細(xì)胞分化增殖等，從而會(huì)顯著的促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。

3.2ADSCs能夠減少創(chuàng)面瘢痕的增生：瘢痕增生在創(chuàng)面愈合過程中往往難以避免，病理性瘢痕的形成常常會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體的美觀和功能，使患者心身健康受到影響，嚴(yán)重者在臨床防治和康復(fù)整形治療上的花費(fèi)甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其原發(fā)疾病的治療費(fèi)用。而ADSCs的局部應(yīng)用能夠通過減少a-SMA和I型膠原的產(chǎn)生，改善膠原的排列等作用，有效的減少創(chuàng)面修復(fù)過程中瘢痕的增生。不僅如此，ADSCs的應(yīng)用還可以軟化皮膚皺紋、通過抑制黑色素合成酶從而抑制黑素細(xì)胞的增殖和黑色素的合成、減少色素沉著、達(dá)到美白的效果，最大限度的恢復(fù)患者創(chuàng)面的外觀和功能，減少患者的心理負(fù)擔(dān)，有可能是未來創(chuàng)面修復(fù)的理想選擇之一。

4.展望

ADSCs作為皮膚組織工程的種子細(xì)胞，既不涉及倫理問題，又有著充足的來源，簡(jiǎn)單易得，但至今尚未發(fā)現(xiàn)一種公認(rèn)、專一的ADSCs特異性標(biāo)記物，所以其分離、培養(yǎng)及鑒別尚無統(tǒng)一模式，有待于進(jìn)一步研究。

雖然組織工程皮膚在燒傷、慢性難愈性創(chuàng)面及先天性皮膚畸形等諸多疾病的治療領(lǐng)域取得了一定的成效，但作為種子細(xì)胞ADCSs向多種組織定向分化的機(jī)制目前尚不明確，而且擴(kuò)增的ADSCs是否有癌變傾向也無數(shù)據(jù)證實(shí)，ADSCs作為種子細(xì)胞與支架材料、細(xì)胞因子相結(jié)合的皮膚替代物的長(zhǎng)期臨床效果還沒有得到很好的證實(shí)，再加上人體皮膚組織本身的復(fù)雜性，以及對(duì)人類皮膚自身結(jié)構(gòu)研究的不透徹性，因此，ADSCs與組織工程化皮膚的研究，要想完全達(dá)到人體正常皮膚功能狀態(tài)仍有很長(zhǎng)的路要走。