不同時間給予去鐵胺對大鼠實驗性顱腦創傷的療效觀察*

張禮均，肖　虹，周　瑋，劉　科（重慶市急救醫療中心神經外科400014）

不同時間給予去鐵胺對大鼠實驗性顱腦創傷的療效觀察*

張禮均，肖虹，周瑋，劉科△（重慶市急救醫療中心神經外科400014）

目的探討不同時間給予去鐵胺對大鼠實驗性顱腦創傷的治療作用。方法選取健康成年雄性SD大鼠39只，體質量210～310 g，隨機分為致傷組、早期治療組和延期治療組，每組13只。制備顱腦創傷模型，早期治療組模型制備2 h即給予去鐵胺100 mg/kg（1 mL生理鹽水稀釋），延期治療組在模型制備3 d后給予等量去鐵胺，而致傷組僅給予等量生理鹽水，均治療至28 d。分別于傷后56 d處死前完成Morris水迷宮實驗，處死動物后完成病理學檢查，包括大體標本、蘇木精-伊紅（HE）和尼氏染色。結果（1）Morris水迷宮實驗：早期治療組大鼠平臺搜索策略和搜索時間［分別為（3.25±0.16）分、（36.58±9.27）s］與致傷組［分別為（2.13±0.30）分、（110.00±16.74）s］比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而延期治療組大鼠平臺搜索策略和搜索時間［分別為（2.50±0.27）分、（96.08±10.66）s］與致傷組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（2）大體標本：去鐵胺早期治療組大鼠大腦缺損體積［（126.68±15.23）mm3］較致傷組［（212.36±18.43）mm3］明顯縮小，差異有統計學意義（P＜0.05）；延期治療組［（178.71±30.36）mm3］與致傷組大鼠大腦缺損體積與比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（3）HE及尼氏染色：早期治療組傷區殘腔周圍殘留片狀細胞皺縮帶較窄，皺縮帶可見較多皺縮神經元分布；延期治療組該皺縮帶較早期治療組有所增寬；致傷組該皺縮帶最明顯，且殘留神經元鮮見。結論大鼠大腦打擊傷后早期（2 h）給予去鐵胺，能顯著改善其空間學習記憶能力、縮小大腦缺損體積及減少致傷灶周圍神經元死亡，從而起到神經保護作用，而延期治療（3d）則無效。

顱腦損傷；創傷和損傷；去鐵胺；時間因素；迷宮學習；大鼠；神經保護

近年來，神經外科發展迅速，顱腦創傷認識水平和監測技術不斷進步，但顱腦創傷的致殘率和死亡率始終居高不下。目前挽救“半暗帶”區域腦組織依然是神經外科關注的焦點。顱腦創傷后直接血腫清除和去骨瓣減壓技術的成熟，對挽救患者生命起到關鍵作用，但繼發腦損害的問題一直困擾著神經外科醫生。有研究發現，顱腦創傷后存在大鼠空間學習記憶能力下降和大腦缺損體積擴大，而早期予以去鐵胺治療，能改善大鼠空間學習記憶能力，縮小大鼠大腦缺損體積［1-3］，但延期治療（3 d）是否有效，目前尚缺乏相關研究。本研究旨在探討去鐵胺治療顱腦創傷的時效關系，明確延期去鐵胺治療顱腦創傷是否有效。

1　材料與方法

1.1材料選取體質量為210～310 g的健康成年雄性SD大鼠（第三軍醫大學大坪醫院動物中心提供）39只，隨機分為早期治療組、延期治療組和致傷組，每組13只。

1.2方法

1.2.1動物模型制備及實驗方法參照文獻［1-3］建立大鼠顱腦創傷模型，并參照Okauchi等［4］方法給藥。致傷組大鼠于致傷后2 h開始給予生理鹽水（1 mL），每12小時1次，持續28 d；早期治療組大鼠給予100 mg/kg去鐵胺，給藥間隔和時間與致傷組一致；延期治療組大鼠則從致傷開始連續3 d給予等量生理鹽水，3 d后給予100 mg/kg去鐵胺。三組大鼠分別于傷后56 d處死前完成Morris水迷宮實驗，處死后完成實驗動物大體標本缺損體積測定、蘇木精-伊紅（HE）和尼氏染色。

1.2.2觀察指標（1）Morris水迷宮實驗：于56 d大鼠處死前，從致傷后51 d開始對各組大鼠進行Morris水迷宮實驗訓練，每天2次，經5 d訓練后，完成Morris水迷宮實驗，以評估實驗大鼠的空間學習記憶力。該裝置主要由直徑180 cm、高60 cm的水池組成，安放的房間要保持一定的暗度，并保持環境不變，平臺可以放置在水池的任何一個假想象限內（本研究將平臺放置在第Ⅱ象限），具體步驟參照文獻［1］。評價方式包括平臺搜索時間（s）和平臺搜索策略（邊緣式1分、隨機式2分、趨向式3分、直線式4分）。（2）大腦缺損體積測定：于56d實驗結束時處死各組大鼠，完整保留大腦組織，采用多田公式計算大鼠大腦缺損體積，并切片觀察大腦缺損情況。（3）HE和尼氏染色：于56 d實驗結束時處死各組大鼠，取各組致傷灶周圍相應部位組織進行HE和尼氏染色，采用光鏡（400×）觀察致傷灶周圍腦組織損傷情況。

1.3統計學處理應用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1Morris水迷宮實驗致傷組大鼠平臺搜索時間為（110.00±16.74）s，平臺搜索策略基本為邊緣式或隨機式，評分（2.13±0.30）分；早期治療組大鼠平臺搜索時間為（36.58±9.27）s，平臺搜索策略以趨向式為主，評分（3.25± 0.16）分；延期治療組大鼠平臺搜索時間為（96.08±10.66）s，平臺搜索策略以隨機式為主，評分（2.50±0.27）分。早期治療組大鼠無論是平臺搜索時間還是搜索策略與致傷組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），而延期治療組與致傷組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1　Morris水迷宮實驗

2.2大體標本致傷組大鼠大腦缺損體積為（212.36± 18.43）mm3，早期治療組為（126.68±15.23）mm3，延期治療組為（178.71±30.36）mm3。與致傷組比較，早期治療組大腦缺損體積明顯縮小，差異有統計學意義（P＜0.05）；而延期治療組則無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠致傷側大腦半球致傷區域腦組織缺損嚴重，缺損直徑（5～7 mm）較打擊桿直徑（4.5 mm）明顯擴大，挫裂傷腦組織大部分壞死、吸收，殘腔均可見少量黃色沉積物。致傷組大鼠致傷側半球殘留額葉和枕葉少量腦實質（圖2A）；早期治療組、延期治療組大鼠致傷側半球腦組織較致傷組多，早期治療組殘留腦實質最多（圖2B、C）。

圖2　各組大鼠大腦缺損體積大體標本形態

2.3HE及尼氏染色致傷組（圖3A、4A）：傷側半球殘留腦組織少，殘腔周圍損傷帶較寬，結構疏松，殘留皺縮神經元鮮見，殘腔可見脈絡叢，對側大腦實質變薄。早期治療組（圖3B、4B）：傷側半球殘留腦組織較多，殘腔周圍損傷帶較窄，結構疏松不明顯，殘留皺縮神經元多見，核濃縮（圖中箭頭所示），殘腔可見脈絡叢。延期治療組（圖3C、4C）：損傷帶損傷程度介于致傷組、早期治療組之間。

圖3　致傷灶周圍腦組織HE染色（400×）

圖4　致傷灶周圍腦組織尼氏染色（400×）

3　討　論

鐵螯合劑去鐵胺是一種金屬絡合物，對鐵離子有高度特異性親和力，能快速與鐵離子形成無活性或活性很弱的復合物排出體外，可減少局部鐵離子濃度，全身給藥后能快速透過血-腦脊液屏障，在腦組織局部高濃度聚集［5］。同時，去鐵胺能降低血紅蛋白誘導的腦組織Na+-K+-ATP酶抑制作用和神經毒性作用［6］。有研究發現，在實驗性腦出血中，鐵離子螯合劑去鐵胺能減少神經元損傷和神經功能缺損，具有神經保護作用［7］。有研究發現，去鐵胺可減輕白質水腫、降低腫瘤壞死因子α和蛋白激酶1水平［8］，認為是潛在治療腦出血的有效藥物。有研究采用腦室注血方法制備腦積水模型，結果發現，去鐵胺能降低腦積水發生率［9］。顱腦創傷后存在血紅蛋白分解產生鐵離子的病理過程，同樣存在鐵離子對腦組織的繼發性損害過程。有研究發現，顱腦創傷后28 d，實驗動物大腦缺損體積增大和空間學習記憶能力下降，早期給予去鐵胺治療后，能減輕這種毒性作用，提示鐵離子在顱腦創傷中具有神經毒性作用［1］。

在臨床上，顱腦創傷患者往往不能在2 h內到達有救治條件的專科醫院。那么，延期（3 d）給予去鐵胺是否具有神經保護作用呢？本研究發現，致傷組大鼠大體標本可見傷側半球殘留少量額葉和枕葉腦組織，而早期治療組、延期治療組大鼠傷側半球殘留腦組織較致傷組明顯增加，且早期治療組更明顯；計算大腦缺損體積發現，與致傷組比較，早期治療組大鼠大腦缺損體積明顯縮小，差異有統計學意義（P＜0.05），而延期治療組大鼠大腦缺損體積縮小不顯著，差異無統計學意義（P＞0.05）；進一步采用Morris水迷宮實驗檢測大鼠空間學習記憶能力發現，早期治療能顯著提高實驗大鼠空間學習記憶能力，但延期治療改善不明顯。有研究發現，去鐵胺能誘導神經元樣細胞增加缺氧耐受能力［10］。而本研究HE和尼氏染色發現，早期治療組殘腔周圍腦組織皺縮細胞帶明顯變窄，而致傷組損傷帶最寬，延期治療組介于致傷組、早期治療組之間，推測這可能與去鐵胺能增加神經缺氧耐受有關，使“半暗帶”腦組織存活下來，而且早期給予去鐵胺效果好，延期給藥效果差。上述結果提示，去鐵胺延期（3 d）給藥療效與致傷組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），而早期給予去鐵胺效果顯著，與致傷組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），能顯著縮小大腦缺損體積，改善實驗動物空間學習記憶能力，減少致傷灶周圍細胞損傷帶。

因此，作者認為，去鐵胺可能是一種治療顱腦創傷的有效藥物。從時效關系上看，早期（2 h）給予去鐵胺療效好，延期（3 d）給藥則無效，當然還需進一步在其他實驗和臨床上加以驗證。本研究結果提示，早期使用去鐵胺可能是治療創傷性顱腦損傷的一種有效方法。

［1］Zhang L，Hu R，Li M，et al.Deferoxamine attenuates iron-induced longterm neurotoxicity in rats with traumatic brain injury［J］.Neurol Sci，2013，34（5）：639-645.

［2］張禮均，胡榮，李飛，等.去鐵胺對大鼠大腦沖擊傷的治療作用［J］.第三軍醫大學學報，2012，34（23）：2349-2352.

［3］張禮均，胡榮，李飛，等.瞬時受體電位通道6在大鼠大腦沖擊傷后鐵代謝中的作用［J］.第三軍醫大學學報，2012，34（23）：2353-2356.

［4］Okauchi M，Hua Y，Keep RF，et al.Effects of deferoxamine on intracerebral hemorrhage-induced brain injury in aged rats［J］.Stroke，2009，40（5）：1858-1863.

［5］Palmer C，Roberts RL，Bero C.Deferoxamine posttreatment reduces ischemic brain injury in neonatal rats［J］.Stroke，1994，25（5）：1039-1045.

［6］Regan RF，Rogers B.Delayed treatment of hemoglobin neurotoxicity［J］.J Neurotrauma，2003，20（1）：111-120.

［7］Hatakeyama T，Okauchi M，Hua Y，et al.Deferoxamine reduces neuronal death and hematoma lysis after intracerebral hemorrhage in aged rats［J］. Transl Stroke Res，2013，4（5）：546-553.

［8］Xie Q，Gu Y，Hua Y，et al.Deferoxamine attenuates white matter injury in a piglet intracerebral hemorrhage model［J］.Stroke，2014，45（1）：290-292.

［9］Zhao J，Chen Z，Xi G，et al.Deferoxamine attenuates acute hydrocephalus after traumatic brain injury in rats［J］.Transl Stroke Res，2014，5（5）：586-594.

［10］Nouri F，Salehinejad P，Nematollahi-Mahani SN，et al.Deferoxamine preconditioning of neural-like cells derived from human wharton′s jelly mesenchymal stem cells as a strategy to promote their tolerance and therapeutic potential：an in vitro study［J］.Cell Mol Neurobiol，2015-08-05［2015-09-01］. http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed.

Effect observation of giving deferoxamine at different time on experimental craniocerebral traumatic injury in rats*

Zhang Lijun，Xiao Hong，Zhou Wei，Liu Ke△（Department of Neurosurgery，Chongqing Municipal Emergency Medical Centre，Chongqing 400014 China）

ObjectiveTo explore the effects of giving deferoxamine at different time on experimental traumatic brain injury（TBI）in rats.Methods39 healthy male adult Sprague-Dawley rats，weighted 210～310 g，were selected and divided into the injury group，early treatment group and delayed treatment group，13 cases in each group.The TBI model was prepared.The early treatment group was given deferoxamine100 mg/kg（dilution by 1mL of normal saline）at 2 h after TBI model preparation，the delayed treatment group was given the same volume of deferoxamine on 3 d after model preparation，while the injury group was given the same volume of normal saline，the treatment lasted for 28 d.Before the rats were killed on 56 d，the Morris water maze test was completed，and then the pathological examination was performed after killing rats，including the gross samples，HE staining and Nissl staining.Results（1）The Morris water maze test：the time of platform search strategy and search time in the early treatment group were（3.25±0.16）scores and（36.58±9.27）s，respectively，which in the injury group were（2.13±0.30）scores and（110± 16.74）s，respectively.The difference was statistically significant（P＜0.05），while which in the delayed treatment group were（2.50± 0.27）scores and（96.08±10.66）s，respectively，showing no statistical difference compared with the injury group（P＞0.05）；（2）the gross samples：the brain defect volume in the early treatment group was（126.68±15.23）mm3，which was significantly decreased compared with the injury group（212.36±18.43）mm3，the difference was statistically significant（P＜0.05），the brain defect volume （178.71±30.36）mm3 in the delayed treatment group showed no statistical difference compared with the injury group（P＞0.05）；（3）the HE and Nissl staining：flaky cellular shrinkage band around residual cavity in the injury area in the early treatment group was relatively narrow，more shrinkage neurons distribution could be found in the shrinkage band；this shrinkage band in the delayed treatment group was somewhat broadened compared with the early treatment group；the shrinkage band in the injury was most obvious，moreover residual neurons were rare.ConclusionEarly given deferoxamine（2 h）after blow injury in rats could significantly improve the ability of space learning and memory，reduces the brain defect volume and peripheral neuron death around injury area，thus plays a neuroprotective effect，while the delayed treatment（3 d）is ineffective.

Craniocerebral trauma；Wounds and injuries；Deferoxamine；Time factors；Maze learning；Rats；Nerve protection

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.01.002

A

1009-5519（2016）01-0005-03

國家自然科學基金青年科學基金資助項目（30901545）；重慶市自然科學基金資助項目（cstc2015jcyjA1061）；重慶市衛生局醫療特色專科資助項目［渝衛科教（2010）52號］。

張禮均（1975-），博士研究生，主治醫師，主要從事顱腦創傷及重癥監護工作。

△，E-mail：liudaoqi@tom.com。

（2015-09-08）