BCL2、BCL6、MUM1蛋白表達及其與彌漫性大B細胞淋巴瘤預后的關系

車江雁，王寶宏（.濰坊醫學院，山東濰坊26000；2.濰坊市人民醫院，山東26000）

BCL2、BCL6、MUM1蛋白表達及其與彌漫性大B細胞淋巴瘤預后的關系

車江雁1，王寶宏2△（1.濰坊醫學院，山東濰坊261000；2.濰坊市人民醫院，山東261000）

目的探討彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）組織中MUM1、BCL2和BCL6蛋白的表達及其與DLBCL臨床病理特征及預后的關系。方法收集山東省濰坊市人民醫院2010年2月至2014年2月80例有完整臨床和隨訪資料的新確診DLBCL患者的病理組織標本，應用免疫組織化學法檢測腫瘤組織中BCL2、BCL6和MUM1蛋白的表達，分析其相互關系及其與DLBCL臨床病理特征及預后的關系。結果80例DLBCL患者腫瘤組織中BCL2、BCL6及MUM1 3種蛋白的陽性表達率分別為36.2%（29/80）、65.0%（52/80）、77.5%（62/80）。MUM1陽性組、陰性組患者平均生存期分別為35.4、51.7個月；BCL2陽性組、陰性組患者平均生存期分別為35.7、47.2個月；BCL6陽性組、陰性組患者平均生存期分別為54.5、35.1個月。MUM1陰性組、BCL6陽性組患者預后相對較好，差異有統計學意義（P＜0.05），而BCL2與DLBCL患者預后的關系尚不確切。結論MUM1、BCL2及BCL6蛋白表達情況為DLBCL的臨床治療和預后分析提供了重要信息，但目前對其作用機制尚缺乏了解，值得深入研究。

DNA結合蛋白質類；原癌基因蛋白質c-bcl-2；淋巴瘤，B細胞/病理學；免疫組織化學；預后

彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuselargeBcelllymphoma，DLBCL）是一種大B細胞彌漫增生性惡性腫瘤，是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin′s lymphoma，NHL）中最常見的組織學類型，占新診斷病例的30%～40%［1］。DLBCL的形態學、免疫表型、分子遺傳學和臨床表現極具異質性，其傳統治療方案是以利妥昔單抗和蒽環類藥物為基礎的免疫化學療法，一些相關方案可以治愈60%～70%的患者［2］。盡管如此，患者對治療的反應及預后仍存在較大差異，仍有較多患者對治療反應差，易復發、轉移或進展，預后不良［3］。近年來，國際預后指數（international prognostic index，IPI）評分已廣泛用于對DLBCL患者的預后評估，但是臨床研究發現，IPI評分相同的患者預后不盡相同［4］。近年來，BCL2、BCL6和MUM1等蛋白與DLBCL的發生及其與臨床預后的關系備受關注，然而分子遺傳學異常與臨床預后的關系存在爭議，了解其發病機制并尋找更好的治療方法成為當前研究的熱點。本研究分析了BCL2、BCL6和MUM1 3種蛋白在80例DLBCL患者腫瘤組織中的表達，并對患者進行跟蹤隨訪，從而為臨床治療及預后分析提供重要及客觀的依據。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1資料來源收集山東省濰坊市人民醫院2010 年2月至2014年2月80例有完整臨床和隨訪資料的新確診DLBCL患者的病理組織標本進行研究。

1.1.2試劑MUM1、BCL2、BCL6兔抗人單克隆抗體［一抗（ab32072、ab45413、ab203619、ab126593）］由艾美捷科技有限公司（Abcam公司）提供，羊抗兔多克隆抗體［二抗（BA1125）］由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2方法

1.2.1染色方法

1.2.1.1石蠟切片的制備與蘇木精-伊紅（hematoxylineosin staining，HE）染色組織標本經10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，進行4 μm厚切片。將切片放入蘇木精中染色10～30 min，之后用自來水流水沖洗15 min，將切片放入1%鹽酸乙醇分化液中褪色，用5%伊紅乙醇染液對比染色2～5 min，HE染色完畢，切片室溫留存以進行觀察。

1.2.1.2免疫組織化學染色制備的組織標本經過脫蠟、水化后，采用Elivision法進行免疫組織化學染色。MUM1、BCL2、BCL6作為陽性對照，三羥甲基氨基甲烷緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.2結果判定根據DLBCL標本中腫瘤細胞內出現清晰定位的棕褐色或棕黃色顆粒來判斷其陽性表現。BCL2、BCL6及MUM1 3種已知標志物應用定性判斷，BCL2以定位于細胞膜和細胞質出現特異著色大于30%為陽性；BCL6和MUM1為細胞核著色大于30%為陽性。

1.2.3治療及隨訪80例患者采用利妥單抗、環磷酰胺、阿霉素、長春新堿聯合潑尼松（R-CHOP）方案治療，隨訪4～60個月。

1.3統計學處理應用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，各陽性組與陰性組間比較采用χ2檢驗；總生存期（overall survival，OS）和無進展生存期（progression-free survival，PFS）分析采用Kaplan-Meier法；單因素生存曲線比較采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1臨床資料和特征80例DLBCL患者中男49例，女31例；男女比例為1.6∶1；中位年齡53歲。腫瘤發生于淋巴結內46例，淋巴結外34例。原發于淋巴結46例，胃8例，大腸7例，小腸7例，扁桃體4例，腮腺2例，睪丸、乳腺、胰腺、甲狀腺、腎、中樞神經系統各1例。根據Ann Arbor分期，Ⅰ～Ⅱ期50例，Ⅲ～Ⅳ期30例。乳酸脫氫酶（LDH）正常（＜240 U/L）44例，升高（≥240 U/ L）36例。IPI評分低于3分51例，≥3分29例。見表1。

2.2形態學表現46例原發于淋巴結DLBCL組織標本多呈彌漫性生長，正常淋巴結結構多不存在，腫瘤細胞增大，呈圓形或卵圓形，細胞質呈嗜酸或嗜雙色性，細胞核增大、偏位，可見一個或多個核仁，嗜酸或嗜堿性（圖1A箭頭所指），R-S細胞較為典型，核分裂象易見（圖1B箭頭所指），多數病例為一致的大B細胞形態；22例胃腸DLBCL組織標本主要表現為彌漫浸潤性生長，破壞黏膜和腺體（圖1C箭頭所指）；其余病例組織標本表現較不典型。

表1　DLBCL組織中3種蛋白表達情況及其與臨床病理特征的關系［n（%）］

圖1　DLBCL腫瘤組織標本HE染色結果（400×）

2.3免疫組織化學法檢測結果BCL2為細胞膜和細胞質著色（圖2A），BCL6（圖2B）和MUM1（圖2C）為細胞核著色。BCL2、BCL6及MUM1 3種蛋白的陽性表達率分別為36.2%（29/80）、65.0%（52/80）、77.5%（62/80），3種蛋白表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2　BCL2、BCL6及MUM1蛋白的免疫組織化學染色結果（400×）

2.43種蛋白表達與DLBCL患者生存期分析80例患者中死亡28例。BCL2陰性組與陽性組患者平均生存期分別為47.2、35.7個月；BCL6陰性組與陽性組患者平均生存期分別為35.1、54.5個月；MUM1陰性組與陽性組患者平均生存期分別為51.7、35.4個月。BCL2表達與DLBCL患者OS具有相關性（P=0.001），陰性組患者預后較陽性組好，差異有統計學意義（P＜0.05），而與PFS無關（P=0.548）；BCL6表達與DLBCL患者OS及PFS均具有相關性（P=0.001、0.002），陽性組患者預后較陰性組好，差異有統計學意義（P＜0.05）；MUM1表達與DLBCL患者OS及PFS均具有相關性（P=0.001），陰性組患者預后較陽性組好，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖3、表2。

圖3　BCL2、BCL6、MUM1陰性組和陽性組患者OS與PFS Kaplan-Meier生存曲線比較

表2　DLBCL組織中3種蛋白表達與生存期的多變量分析

3　討　論

本研究通過檢測80例DLBCL患者腫瘤組織中BCL2、BCL6和MUM1 3種蛋白的表達情況對患者臨床特征進行了比較，并對預后進行分析。BCL2、BCL6及MUM1蛋白陽性表達率分別為36.2%、65.0%和77.5%，3種蛋白表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；MUM1陰性組和BCL6陽性組患者預后相對較好（P＜0.05），而BCL2與DLBCL患者預后的關系尚不確切。

BCL2蛋白為一種抗凋亡蛋白，可調節線粒體、控制細胞色素C和其他凋亡因子的釋放，對抑制凋亡具有重要作用［5］。但是有研究發現，BCL2蛋白的表達僅與DLBCL的分型有關，而與患者預后無關［6-7］。本研究結果表明，BCL2陽性表達主要發生于生發中心樣 B細胞（GCB）型DLBCL患者，與Ann Arbor分期、年齡、性別等無關（P＞0.05），與低危IPI評分比較，差異有統計學意義（P=0.031），但Kaplan-Meier生存曲線和COX回歸分析提示，BCL2的表達與DLBCL患者OS具有相關性（P=0.001），陰性組患者預后較陽性組好，差異有統計學意義（P＞0.05），而與患者PFS無關（P=0.548）。

BCL6是B細胞分化的抑制性基因，其低表達是腫瘤發生的一個重要因素，BCL6基因重排通過一系列調控機制，致使BCL6蛋白表達發生異常變化［8-10］。本研究結果顯示，BCL6陽性表達患者多處于Ann Arbor分期的Ⅰ～Ⅱ期，與Ⅲ～Ⅳ期比較，差異有統計學意義（P=0.037），與低危IPI評分、年齡、性別等比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；根據Kaplan-Meier生存曲線和COX回歸分析，BCL6的表達與DLBCL患者OS及PFS均具有相關性（P=0.001、0.002），陽性組患者預后較陰性組好，差異有統計學意義（P＜0.05）。

MUM1為一種骨髓瘤相關基因，在免疫系統的發育過程，即淋巴細胞活化和B細胞分化中具有關鍵性作用，提示DLBCL患者的亞型non-GCB分型［11］。本研究發現，86.7%（26/30）MUM1蛋白陽性患者處于Ann-Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期，并且為高危IPI評分患者，二者差異有統計學意義（P=0.016），但與年齡、性別等比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。根據Kaplan-Meier生存曲線和COX回歸分析，MUM1的表達與DLBCL患者的OS及PFS均具有相關性（P=0.001），陰性組患者預后較陽性組好。與Hans等［12］研究發現MUM1陽性患者預后較陰性患者差的結果一致。

綜上所述，本研究對80例DLBCL患者采用R-CHOP方案治療，具有臨床治療的一致性，MUM1陰性組和BCL6陽性組患者臨床特征和預后均相對較好，而BCL2與DLBCL患者預后的關系尚不確切。對于已經確診為DLBCL的患者，BCL2、BCL6和MUM1 3種蛋白可以作為生物標志物進行聯合分析，對患者的治療和預后可進行更佳的選擇與判斷。

［1］Akyurek N，Uner A，Benekli M，et al.Prognostic significance of MYC，BCL2，and BCL6 rearrangements in patients with diffuse large B-cell lymphomatreated with cyclophosphamide，doxorubicin，vincristine，and prednisone plus rituximab［J］.Cancer，2012，118（17）：4173-4183.

［2］孫冠星，曹祥山，王志林，等.BCL-6、MYC和p53基因異常與彌漫性大B細胞淋巴瘤免疫學亞型及預后的關系［J］.中華醫學遺傳學雜志，2012，29（5）：576-581.

［3］Sehn LH，Berry B，Chhanabhai M，et al.The revised International Prognostic Index（R-IPI）is a better predictor of outcome than the standard IPI for patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with R-CHOP［J］. Blood，2007，109（5）：1857-1861.

［4］ Wilder RB，Rodriguez MA，Medeiros LJ，et al.International prognostic index-based outcomes for diffuse large B-cell lymphomas［J］.Cancer，2002，94（12）：3083-3088.

［5］Green DR，Kroemer G.The pathophysiology of mitochondrial cell death［J］. Science，2004，305（5684）：626-629.

［6］Zeng LP，Wen YL，Ma Y，et al.Mechanism and clinical significance of antiapoptotic gene bcl-2 expression in diffuse large B-cell lymphoma［J］. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2011，40（6）：377-381.

［7］Visco C，Tzankov A，Xu-Monette ZY，et al.Patients with diffuse large B-cell lymphoma of germinal center origin with BCL2 translocations have poor outcome，irrespective of MYC status：a report from an International DLBCL rituximab-CHOP Consortium Program Study［J］.Haematologica，2013，98（2）：255-263.

［8］Copie-Bergman C，Gaulard P，Leroy K，et al.Immuno-fluorescence in situ hybridization index predicts survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with R-CHOP：a GELA study［J］.J Clin Oncol，2009，27（33）：5573-5579.

［9］Sanders L，Jayne S，Kennedy B，et al.A Double Hit CD10-Negative BCell Lymphoma with t（3；8）（q27；q24）Leading to Juxtaposition of the BCL6 and MYC Loci Associated with Good Clinical Outcome［J］.Case Rep Hematol，2014，2014：120714.

［10］Iqbal J，Greiner TC，Patel K，et al.Distinctive patterns of BCL6 molecular alterations and their functional consequences in different subgroups of diffuse large B-cell lymphoma［J］.Leukemia，2007，21（22）：2332-2343.

［11］Rahimi H，Jafarian A，Samadi A，et al.Evaluation of BCL6 and MUM1 expression in patients with diffuse large B cell lymphoma and their correlations with staging and prognosis in Iran［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（1）：83-86.

［12］Hans CP，Weisenburger DD，Greiner TC，et al.Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray［J］.Blood，2004，103（1）：275-282.

Expressions of BCL2，BCL6 and MUM1 protein and their relationship with prognosis of diffuse large B cell lymphoma

Che Jiangyan1，Wang Baohong2△（1.Weifang Medical University，Weifang，Shandong 261000，China；2.Weifang Municipal People′s Hospital，Weifang，Shandong 261000，China）

ObjectiveTo investigate the expressions of MUM1，BCL2 and BCL6 protein in diffuse large B cell lymphoma（DLBCL）tissue and their relation with the DLBCL pathological characteristics and prognosis.MethodsThe pathological tissue samples in 80 cases of newly diagnosed DLBCL with intact clinical and follow up data in the Weifang Municipal People′s Hospital from February 2010 to February 2014 were collected.The immunohistochemistry technique was used to assess the expressions of MUM1，BCL2 and BCL6 protein in DLBCL tissue，then their mutual relationship and the relation with clinical pathological characteristics and prognosis were analyzed.ResultsThe positive expression rates of BCL2，BCL6，MUM1 protein in 80 cases of DLBCL were 36.3%（29/80），65%（52/80）and 77.5%（62/80）respectively.The average survival time in the MUM1 positive group and negative group were 35.4 months and 51.7 months respectively，which in the BCL2 positive group and negative group were 35.7 months and 47.2 months，which in the BCL6 positive group and negative group were 54.5 months and 35.1 months respectively.The BCL6 positive and MUM1 negative groups showed relatively better prognosis，the difference was statistically significant（P＜0.05）.But the relation between BCL2 and prognosis in the patients with DLBCL was still inexact.Conclusion The expression situation of MUM1，BCL2 and BCL6 protein provides the important information for clinical therapy and prognosis of DLBCL.But it is still a lack of understand on its action mechanism，which is worth deep research.

DNA-binding proteins；Proto-oncogene proteins c-bcl-2；Lymphoma，B-Cell/pathology；Immunohistochemistry；Prognosis

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.01.009

A

1009-5519（2016）01-0025-03

車江雁（1989-），碩士研究生，主要從事血液系統疾病及血液腫瘤的研究。

△，E-mail：77160520@qq.com。

（2015-10-14）