羊棲菜多糖通過VEGF途徑抑制胃癌細胞誘導的腫瘤血管內皮細胞增殖的實驗研究

陳慧玲，李培飛，陳聲燦，況 煒，郭俊明

羊棲菜多糖通過VEGF途徑抑制胃癌細胞誘導的腫瘤血管內皮細胞增殖的實驗研究

陳慧玲，李培飛，陳聲燦，況 煒，郭俊明

目的 研究羊棲菜多糖（SFPS）抑制腫瘤血管內皮細胞增殖的作用機制。方法 采用實時細胞分析系統監測不同濃度SFPS對腫瘤血管內皮細胞增殖的影響，酶聯免疫吸附法（ELISA）測定腫瘤細胞培養上清液VEGF-A的分泌，實時熒光定量PCR檢測腫瘤細胞VEGF-AmRNA及腫瘤血管內皮細胞VEGFR-2mRNA的水平。結果 SFPS可抑制腫瘤血管內皮細胞的增殖，并呈濃度和時間依賴性。300、1 000 mg/L SFPS作用12 h即出現抑制作用（均＜0.05），30、100 mg/L SFPS作用24 h表現抑制作用（均＜0.05），而作用36及48 h各濃度組SFPS與對照組差異均有統計學意義（均＜0.05）。SFPS（30、100、300mg/L）作用36h后，能明顯降低MGC-803細胞培養上清VEGF-A的含量（均＜0.05）。PCR結果顯示，100、300mg/LSFPS能降低MGC-803細胞VEGF-A及腫瘤血管內皮細胞VEGFR-2的轉錄水平（均＜0.05）。結論 SFPS具有抑制腫瘤血管內皮細胞增殖的作用，其作用機制與下調腫瘤細胞VEGF-A和腫瘤血管內皮細胞VEGFR-2的表達有關。

羊棲菜；多糖類；胃腫瘤；癌；內皮，血管；血管內皮生長因子

[Modem Piactical Medicine, 2016,28(6):710-712]

羊棲菜多糖（SFPS）提取自海藻羊棲菜，體內外研究均表明SFPS具有顯著的抗腫瘤活性[1-3]，但其作用機制尚未明確。筆者前期研究發現，SFPS可通過抑制腫瘤血管內皮細胞的增殖而抑制腫瘤的生長[4]。本實驗擬利用人胃癌MGC-803細胞誘導的血管內皮細胞模型，進一步探討SFPS對腫瘤血管內皮細胞增殖的作用機制。報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞MGC-803，人臍靜脈血管內皮細胞HUVECs，均來源于中國科學院上海細胞庫；SFPS由浙江大學藥學院藥物分析中心提供，多糖含量53%。

1.2 主要試劑與儀器 RPMI1640培養基、人內皮細胞無血清培養基（HESFM），小牛血清（美國Gibco），總 RNA提取試劑 TRIzol（美國 Ambion），VEGF-A、VEGFR-2和 -actin引物（上海Sangon）；人VEGF-A定量ELISA檢測試劑盒（美國R﹠amp;D systems），逆轉錄、qRT-PCR反應試劑盒（美國Promega）；xCELLigence實時細胞分析系統、E-plate96孔板（美國ACEA Biosciences），Modle500酶聯免疫檢測儀（美國Bio-Rad），Mx3005P熒光定量PCR儀（美國Stratagene）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 在37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下，人胃癌細胞 MGC-803于含 10%小牛血清的RPMI 1640培養基中傳代培養，人臍靜脈血管內皮細胞HUVECs培養于含10%小牛血清的HESFM培養基。

1.3.2 腫瘤條件培養基制備 參照Tu等[5]的腫瘤條件培養基制備方法并進行改良，待MGC-803細胞生長融合至70%時，將培養瓶中的培養基更換為無血清的1640培養基，48h后收集上清液，2000r/min離心10min去除細胞碎片，并以0.22m微孔濾膜過濾除菌，―70℃保存備用。使用時，將上述MGC-803細胞上清液與HESFM培養基以1︰1比例混合，即為腫瘤條件培養基，實驗中用以HUVECs的誘導培養。

1.3.3 實時監測細胞增殖活性 E-plate每孔加入100l腫瘤條件培養基以測定背景值，然后再向E-plate每孔加入100l HUVECs細胞懸液（1×104細胞/孔），并將E-plate置于xCELLigence實時細胞分儀上。培養20 h待細胞生長穩定后，加入不同濃度SFPS（終濃度分別為10、30、100、300和1000mg/L），并設空白對照組，每組6個復孔。儀器每隔15 min檢測一次細胞指數（cell index,CI），監測48 h。

1.3.4ELISA法檢測VEGF-A釋放 MGC-803細胞以1×104細胞/孔的密度接種于96孔板，細胞生長達到飽和狀態時，更換為無血清1640培養基，同步培養12h后，加入終濃度分別為30、100和300mg/L的SFPS，同時設空白對照，每組6復孔。作用36 h后，收集細胞培養上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行VEGF含量檢測。

1.3.5 實時熒光定量PCR法檢測VEGF-A和VEGFR-2的 mRNA表達 分別收集經30、100和300 mg/L濃度的SFPS作用36h后的MGC-803和HUVECs細胞，TRIzol法提取各組細胞的總RNA，按照試劑盒說明逆轉錄為cDNA，進行熒光定量PCR擴增，各樣本重復3次。PCR引物序列見表1，以 -actin為內參。反應條件如下：95℃預變性5min，94℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45個循環。目標基因表達的相對水平分析采用2-△△CT法[6]。

1.4 統計方法 數據采用SPSS16.0軟件進行分析，計量數據以均數±標準差表示，多組間比較采用檢驗，多重比較采用LSD-檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SFPS對 MGC-803胃癌細胞誘導的血管內皮細胞增殖活性的影響 實時細胞分析系統檢測結果表明，SFPS在30～1000mg/L濃度范圍內作用24h以上對人胃癌MGC-803細胞誘導的HUVECs增殖具有明顯的抑制作用（≥3.25，均＜0.01），并呈濃度-時間相關性（封二彩圖1）。而作用36h、48h，各濃度SFPS組與對照組差異均有統計學意義（≥3.76，均＜0.01）。此外，高濃度（300、1000 mg/L）SFPS作用12h即出現明顯的抑制作用（≥2.24，均＜0.05）。

2.2 SFPS對MGC-803胃癌細胞分泌VEGF-A的影響 與空白對照組比較，SFPS作用 36 h后，MGC-803細胞上清液中VEGF-A的含量明顯降低，30、100及300 mg/L濃度組與對照組差異均有統計學意義（≥2.82，均＜0.05），見表2。

2.3 SFPS對MGC-803胃癌細胞VEGF-A表達水平的影響 熒光實時定量RT-PCR檢測結果表明，SFPS作用36 h后，VEGF-A在 MGC-803胃癌細胞中的mRNA水平有所下降，其中100及300 mg/L濃度組與對照組差異均有統計學意義（≥3.43，均＜0.05），見封二彩圖2。

表1 引物序列

表2 SFPS對MGC-803細胞上清液中VEGF-A含量的影響（=6）

2.4 SFPS對 MGC-803胃癌細胞誘導的血管內皮細胞 VEGFR-2表達水平的影響 SFPS作用于MGC-803誘導的血管內皮細胞36h后，采用RT-PCR進行檢測，結果發現VEGFR-2的mRNA水平在血管內皮細胞中顯著下降，對照組與100及300 mg/L濃度組差異均有統計學意義（≥4.11，均＜0.05），見封二彩圖3。

3 討論

血管生成是腫瘤發生發展的重要環節，腫瘤的生長、侵襲以及轉移均有賴于新生血管的形成來提供足夠的營養物質。腫瘤血管生成起始于腫瘤細胞釋放促血管生成的調節因子，進而誘導血管內皮細胞增殖、遷移并形成管腔[7]。VEGF是目前發現的作用最強的促血管生成的誘導因子，其生物學效應是由相應受體介導而實現的。在VEGF家族中，VEGFA及其受體VEGFR-2主要參與血管生成的調控，成為調節內皮細胞增殖和移動的關鍵因素[8]。因此，通過阻斷或干擾VEGF-A及其受體的作用，抑制血管內皮細胞增殖，可達到抗腫瘤血管生成的目的。

本研究利用胃癌MGC-803細胞培養上清液制備的腫瘤條件培養基，建立腫瘤細胞誘導的腫瘤血管內皮細胞模型。腫瘤細胞培養上清液含有多種細胞因子，可明顯促進血管內皮細胞的增殖和遷移能力[9]，使正常的血管內皮細胞表現腫瘤血管內皮細胞的特性[10]。實時細胞監測結果證實，多組SFPS對MGC-803胃癌細胞誘導的腫瘤血管內皮細胞增殖具有抑制作用，并有劑量和時間相關性，此結果與項目組前期發現的結果一致[4]。ELISA法檢測結果顯示，SFPS可降低MGC-803細胞上清液中VEGF-A的含量。而實時熒光定量PCR檢測結果表明，SFPS也可降低MGC-803胃癌細胞中VEGF-A的mRNA表達水平，同時也降低了MGC-803誘導的腫瘤血管內皮細胞中VEGFR-2的mRNA水平。以上結果提示，SFPS對腫瘤血管內皮細胞的增殖抑制作用與VEGF途徑密切相關，SFPS不僅直接導致腫瘤血管內皮細胞的VEGFR表達水平顯著下降，也使腫瘤細胞的VEGF表達和分泌水平下降。

綜上所述，SFPS可通過VEGF途徑干擾腫瘤細胞與血管內皮細胞之間的相互作用，抑制腫瘤血管內皮細胞的增殖。此效應提示SFPS具有抑制腫瘤血管生成的作用，切斷腫瘤組織的營養供給，抑制腫瘤的生長和轉移，但其具體的分子機制還有待于進一步的研究分析。

[1]Ji YB, Ji CF, Yue L. Human gastric cancer cell line SGC-7901 apoptosis induced by SFPS-B2 via a mitochondrial-mediated pathway [J].Biomed Mater Eng, 2014, 24(1):1141-1147.

[2]Chen X, Nie W, Yu G, et al. Antitumor and immunomodulatory activity of polysaccharides from Sargassum fusiforme[J]. Food Chem Toxicol, 2012, 50(3/4):695-700.

[3]欒志偉,東方,季宇彬,等.羊棲菜多糖抗腫瘤作用的研究進展[J].黑龍江醫藥,2013,26(4):592-594.

[4]況煒,陳慧玲.羊棲菜多糖對人肺癌細胞及腫瘤血管內皮細胞模型增殖活性的影響[J].現代實用醫學,2011,23(3):256-257,267.

[5]Tu ML, Wang HQ, Chen LJ, et al. Involvement of Akt1/protein kinase Balpha in tumor conditioned medium-induced endothelial cell migration and survival in vitro[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2009, 135(11):1543-1550.

[6]Sun WL, Wu YB, Yu X, et al. Decreased expression of long noncoding RNA AC096655.1-002 in gastric cancer and its clinical significance[J]. Tumour Biol, 2013, 34(5):2697-2701.

[7]Gupta MK, Qin RY. Mechanism and its regulation of tumor-induced angiogenesis[J]. World J Gastroenterol, 2003, 9(6):1144-1155.

[8]董宏超,翟校楓.VEGFA-VEGFR2相關信號蛋白作用機制的研究進展[J].現代腫瘤醫學,2014,22(9):2231-2233.

[9]張婷,蔣春雷.腫瘤條件培養基對人臍靜脈內皮細胞增殖、黏附、遷移能力的調節[J].生理學報,2011,63(3):256-260.

[10]向邦德,呂明德,黃潔夫,等.誘導正常血管內皮細胞具備腫瘤血管特性的研究[J].中山大學學報:醫學科學版,2005,26(3):354-357.

Inhibition of Sargassum fusiforme polysaccharides on the proliferation of tumor vascular endothelial cells induced by gastric tumor cells via regulating vascular endothelial growth factor

CHEN HuiLing,LI Feifei, CHEN Shengcan, KUANG Wei, GUO Junming (Ningbo College of Heahh Sciences, Ningbo 315010, Zhging, China)

Objective To investigate the inhibition and its mechanism of Sargassum fusiforme polysaccharides (SFPS) on the proliferation of tumor vascular endothelial cells.Methods Real time Cellular Analysis was performed to observe the effect of SFPS on the proliferation of tumor vascular endothelial cells. VEGF-A in the supernatant of tumor cells was measured by ELISA. Quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction was employed to detect the mRNA levels of VEGF-A in tumor cells and VEGFR-2 in tumor vascular endothelial cells. Results SFPS inhibited the proliferation of tumor vascular endothelial cells in a dose and time dependent manner. After treatment for 12 h, 300 mg/L and 1000 mg/L SFPS could inhibit the cells growth ( P＜ 0.05). And 30 mg/L and 100 mg/L SFPS inhibited the cells growth after treatment for 24 h ( P＜ 0.01). While after treatment of SFPS for 36 h and 48 h, the proliferation of cells significantly decreased (all 0.01). VEGF-A in the supernatant of MGC-803 cells was obviously lower after treatment of SFPS (30, 100, 300 mg/L) for 36 h ( P＜ 0.05). SFPS at 300mg/L and 1000mg/L concentration could reduce the expression of VEGF-A in MGC-803 cells and VEGFR-2 in tumor vascular endothelial cells (all P＜ 0.05) .Conclusions SFPS could inhibit the proliferation of tumor vascular endothelial cells by reducing the expressions of VEGF-A in tumor cells and VEGFR-2 in tumor vascular endothelial cells.

Sargassum fusiforme Polysaccharides; Gastric neoplasm; Carcinoma; Endothelium; Vascular; Vascular endothelial growth factor

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.06.005

R331.3+2

A

1671-0800(2016)06-0710-03

2016-03-14

（本文編輯：鐘美春）

寧波市自然科學基金（2013A610214）；浙江省高等學校訪問學者發展項目（FX2013259）

315104寧波，寧波衛生職業技術學院（陳慧玲、況煒）；寧波大學醫學院（李培飛、陳聲燦、郭俊明）

況煒，Email：kwei93@126.com