α-淀粉酶基因在腸膜明串珠菌基因表達中的應用

田云飛,劉曉莉,成文玉,金紅星

(河北工業大學化工學院,天津 300130)

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α-淀粉酶基因在腸膜明串珠菌基因表達中的應用

田云飛,劉曉莉,成文玉,金紅星*

(河北工業大學化工學院,天津 300130)

目的:為了驗證α-amy(α-淀粉酶基因)在腸膜明串珠菌中應用的可行性,構建重組質粒并建立了腸膜明串珠菌的三親雜交體系。方法:以大腸桿菌-明串珠菌的穿梭載體pCW4為基礎,構建了攜帶α-amy標記的重組質粒pCW7。腸膜明串珠菌ATCC8293(Leuconostocmesenteroides)的g6ph(6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因)表達盒插入到pCW7,并通過三親雜交轉化腸膜明串珠菌而獲得重組菌株。結果:重組菌株的甘露醇產量比原始菌株提高了7%。三親雜交中可以通過α-amy標記篩選重組子。結論:證實了α-amy標記在腸膜明串珠菌中應用的可行性。

腸膜明串珠菌,α-淀粉酶基因,三親雜交,6-磷酸葡萄糖脫氫酶

在基因工程中通常以抗生素抗性基因作為正篩選標記,進行轉化子的篩選與鑒定,是因為抗生素的抗性基因表達盒一般都比較小,只有1.0 kb左右,便于利用。乳酸細菌的轉基因中普遍應用的抗生素是紅霉素[1-5],但它有一些不足之處,比如,以大腸桿菌為受體菌在平板上進行篩選時,較低濃度容易產生誘導抗性而長出一大片菌落,而使用較高濃度時轉化子生長緩慢且菌落數量銳減。因此,本研究欲利用α-淀粉酶基因(α-amy)標記解決這一難題。另外,α-amy是可應用于食品和藥物生產的安全標記。

明串珠菌是泡菜、腌菜等發酵蔬菜中的優勢菌株[6],是能產生乳酸、甘露醇、雙乙酰、細菌素的革蘭氏陽性乳酸細菌,還應用于乳制品的加工過程中,因此近年來在內地對其研究比較活躍[7]。明串珠菌通常采用電穿孔法進行轉化,但是它對儀器要求嚴格,不但成本高且維修周期長,給實驗研究帶來諸多不便。三親接合轉移(三親雜交)是在細菌中廣泛應用的轉化手段[8],不需要特殊的儀器設備,拓寬了革蘭氏陽性細菌的基因轉化途徑,然而在腸膜明串珠菌中尚未建立相應的方法,因此本研究構建腸膜明串珠菌的三親雜交體系。

6-磷酸葡萄糖脫氫酶(g6ph)催化PPK途徑中的6-磷酸葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖酸,并產生NADH。蔗糖通過透性酶進入腸膜明串珠菌的胞內,經蔗糖磷酸化酶裂解為1-磷酸葡萄糖和果糖,果糖最終加氫還原為甘露醇,這一氫來源于NADH。因此,本研究通過g6ph的過表達,驗證了α-amy標記和三親雜交體系的可行性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

腸膜明串珠菌CGMCC1.10327、攜帶pRK2013(kanr)的大腸桿菌(輔助菌)和pSET152(Eryr)本實驗室保藏,腸膜明串珠菌ATCC8293、食淀粉乳桿菌CGMCC1.3395中國普通微生物菌種保藏管理中心;pTA2載體TOYOBO;Taq酶、內切酶、連接酶大連寶生物公司;質粒小量提取試劑盒Axygen公司。

KF960 PCR儀Heal Force;UV-1100紫外-可見分光光度計Mapada。

1.2實驗方法

1.2.1培養基與培養條件大腸桿菌用LB液體培養基于37 ℃、180 r/min振蕩培養,腸膜明串珠菌、食淀粉乳桿菌用MRS液體培養基于30 ℃、120 r/min振蕩培養。發酵產甘露醇的液體培養基:蔗糖20 g、蛋白胨5 g、酵母浸粉2.5 g、硫酸錳0.02 g、磷酸氫二鉀1 g、檸檬酸銨1 g、乙酸鈉2.5 g,溶于1 L雙蒸水中。在大腸桿菌的培養中紅霉素(Ery)用量為300 μg/mL,在腸膜明串珠菌的培養中氨芐青霉素(Amp)用量為5 μg/mL。

1.2.2引物合成與載體構建本研究中使用的引物列于表1。根據GenBank的相關核苷酸序列,用Oligo6.0設計引物并由華大基因公司合成。

表1　本研究中使用的引物

以大腸桿菌-明串珠菌的穿梭質粒pCW4[9]為基礎,插入Ampr后切除Eryr并插入了oriT,最后再插入α-amy而成為pCW7。構建過程見圖1。

圖1　pCW7質粒的構建流程Fig.1　The process for construction of the pCW7 plasmid

1.2.3三親本雜交過夜培養的供體菌(大腸桿菌,含攜帶oriT基因的pCW7-g6ph)、輔助菌分別以1%的接菌量轉接到新鮮的LB液體培養基中,受體菌(腸膜明串珠菌CGMCC1.10327)按1%的接菌量轉接到新鮮的MRS液體培養基中。分別培養到OD600為0.6時,將三者按體積比例(mL)0.4∶0.4∶0.6混勻,菌體用MRS培養基洗滌2次,溶于100 μL MRS培養基中。均勻涂布于含0.005%(W/V)錐蟲藍、1%可溶性淀粉和0.1 mol/L CaCl2的MRS轉化平板中,30 ℃培養5 h后,用含5 mg/mL Amp和50 mg/mL萘啶酮酸的水溶液1 mL均勻覆蓋平板培養基表面[10],培養72 h,得到的藍色菌落即為重組菌株。

為了優化受體菌的三親雜交條件,分別就受體菌的OD值、三種菌的混合比例、Amp的濃度和抗生素覆蓋時期等單因素條件進行三親雜交實驗,并統計轉化后平板上長出的藍色菌落個數,即為接合轉移子數目。進行對照實驗,將三種菌混合液100 μL以一定倍數稀釋后取100 μL,涂布于轉化平板上,覆蓋平板培養基表面時用只含萘啶酮酸而不含Amp的水溶液,獲得的菌落個數乘以其稀釋倍數作為受體菌落形成單位。

每個單因素實驗做3組平行實驗,統計每個平板上的菌落數,算出其數值平均值作為最終數據。按照公式(接合轉移頻率=接合轉移子數目/受體菌落形成單位(cfu)[11])算出結合轉移頻率,采用Origin8.0數據處理軟件作圖,根據圖線的趨勢選出最佳條件。

1.2.4發酵產甘露醇原始菌和重組菌用發酵培養基進行搖瓶發酵20 h,根據張曉卿的方法[12]測定甘露醇含量。

2　結果與討論

2.1重組載體構建

本研究以pCW4為基礎構建了pCW7。其中所有的目標插入片段都采用PCR擴增,其瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。在圖2中,與DNA marker條帶相比較而得知,PCR產物的大小合適,通過測序獲得的序列與GeneBank的相關序列比對也證實了它們的正確性。通過瓊脂糖凝膠電泳,篩選了重組子,根據質粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率的不同,選出疑似重組子,然后通過酶切驗證,結果見圖3。由圖可知,疑似重組子經過特定酶切可以切為兩條帶,一條與目的片段的PCR產物大小一致,另一條與載體在相同酶切下的產物大小一致,證明其確實為重組子。又通過PCR再次驗證了重組子。

圖2　PCR產物電泳圖Fig.2　PCR amplified product注:1,4,5,8為DNA Marker,2為Ampr,3為oriT,6為amy(模板為食淀粉乳桿菌染色體),7為amy(模板為pTA2-amy)。

圖3　重組質粒酶切驗證電泳圖Fig.3　Result of recombinant plasmid verified by digestion注:1為Amp PCR產物;2為重組子pCW5的BamHI酶切產物;3為載體pCW4的BamHI酶切產物;4為重組子pCW6的XbaI酶切產物;5為DNA marker;6為載體pCW5的XbaI酶切產物;7為α-Amy PCR產物;8為重組子pCW7的XhoI酶切產物;9為載體pCW6的XhoI酶切產物;10為g6ph PCR產物;11為重組子pCW7-g6ph的SalI酶切產物;12為載體pCW7的SalI酶切產物。

利用g6ph-u/g6ph-d引物,以腸膜明串珠菌ATCC8293的總DNA為模板,克隆了g6ph表達盒,經SalI酶切后插入到pCW7中,成為pCW7-g6ph。

2.2三親雜交體系的優化

2.2.1受體菌OD600值對接合轉移頻率的影響考察了受體菌的OD600值對三親雜交的影響,結果見圖4。從圖4可以看出,OD600為0.6時接合轉移頻率最高。

圖4　宿主菌OD600對接合轉移頻率的影響Fig.4　Effect of OD600 of recipient cell on conjugation efficiency

2.2.2三種菌混合比例對接合轉移頻率的影響比較了供體菌、輔助菌和受體菌三者不同比例的三親雜交實驗,結果見圖5。由圖5可知,當比例為1∶1∶1.5時,接合轉移頻率最高。

圖5　三種菌株比例對接合轉移頻率的影響Fig.5　Effect of ratio of three types strain on conjugation efficiency

2.2.3抗生素Amp濃度的選擇不同Amp濃度條件下進行了三親雜交實驗,接合轉移效果見圖6。由圖6可知,當Amp為5 mg/L時,接合轉移頻率最高。Amp低于5 mg/L時,因誘導抗性而產生大量的假陽性菌落,而抗生素濃度過高,抑制接合子的生長。

圖6　Amp濃度對接合轉移頻率的影響Fig.6　Effect of concentration of ampicillin on conjugation efficiency

2.2.4覆蓋時期的選用3種菌株混合物涂布于MRS平板后,不同時期用Amp和萘啶酮酸覆蓋平板,結果見圖7。由圖7可知,培養5 h是最佳的覆蓋時期,超過6 h時,長出大量假陽性菌落,而時間過早抑制接合子的生長。

圖7　覆蓋時間對接合轉移頻率的影響Fig.7　Effect of time on conjugation efficiency

受體菌的OD600值和三種菌混合比例的探索,是用CaCl2洗滌混合菌2次后置于平板的濾紙上而進行三親本雜交的[13],其接合轉移頻率非常低,且十分不穩定。可能是由于微孔濾紙阻隔菌吸收營養物質、CaCl2的處理時期和時間不適而造成的。采用藥物覆蓋法[10]優化了Amp濃度和藥物覆蓋時期,接合轉移頻率大大提高。

2.3利用α-淀粉酶基因標記篩選重組子

含0.005%(W/V)錐蟲藍、1%可溶性淀粉的MRS平板中接合子菌落的顏色為藍色,見圖8。用溶菌酶處理腸膜明串珠菌菌體后,采用小量提取試劑盒提取了接合子的質粒,進行瓊脂糖凝膠電泳,結果見圖9。電泳結果表明,該藍色菌落含有與供體菌的pCW7-g6ph大小一致的重組質粒,證明該藍色菌落就是接合子。隨著時間的推移,藍色平板的顏色越來越淡,而接合子菌落的顏色越來越深。由此可知,菌落的顏色是接合子吸附藍色的錐蟲藍而導致的,但是含淀粉酶基因標記的菌落變藍的機理還不清楚。

圖8　接合子Fig.8　Conjugant

圖9　接合子鑒定Fig.9　Identification of conjugant注:1.原始菌株；2.接合子；3.pCW7-g6ph。

馬向東等[14]認為,含淀粉的平板中加入錐蟲藍時,更容易觀察到枯草芽孢桿菌分泌的淀粉酶溶解淀粉而出現的透明圈。但本研究中并沒有觀察到明顯的透明圈,可能是淀粉酶基因在腸膜明串珠菌中表達緩慢且活性低的緣故。于是用液體培養接合子12 h后,取菌液1 μL滴于含淀粉的MRS平板中,放置18 h后用I2-KI溶液噴灑平板,發現有明顯的透明圈產生,見圖10。由圖10可知,接合子確實有淀粉酶活性。

圖10　接合子的淀粉酶溶解淀粉實驗Fig.10　Starch test of amylase from conjugant

本研究克隆的α-amy片段為2.0 kb,包括啟動子和信號肽序列,但只含有部分的3′端重復序列。Eric[15]分離的食淀粉乳桿菌α-amy基因表達盒為2862 bp,其3′端有5個273 bp重復序列,Eric認為此重復序列與淀粉酶活性無關。陳孝禮[16]分析了食淀粉乳桿菌的α-amy基因結構,也認為其3′端重復序列對淀粉酶的異源表達活性沒有影響。綜上所述,3′端的重復序列與與淀粉酶活性無關。

篩選重組子時利用菌落的顏色非常簡便,例如Li等[17]利用了靛藍素基因、Takahashi等[18]利用了非核糖體肽合成酶催化產生的一種藍色染料。但是這些產生顏色的基因,其表達盒都很大,不利于應用,如靛藍素基因為4.9 kb、非核糖體肽合成酶基因4.8 kb。淀粉酶基因只有2.0 kb,因此在實際應用中占優勢。

2.4搖瓶發酵產甘露醇

利用發酵培養基培養20 h后,重組菌的甘露醇含量為10.1 g/L,比原始菌(9.4 g/mL)提高了約7%。這一數據與預期相符,說明6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的過表達可以提高NADH通量,進而對終產物甘露醇的合成起促進作用。Gaspar等[19]在乳球菌中通過敲除乳酸脫氫酶基因而減少NADH的消耗,使甘露醇產量得到了提高。由此可見,增加NADH通量的手段,可以提高甘露醇的產量。

3　結論

α-淀粉酶基因作為篩選標記可以應用于腸膜明串珠菌的基因工程中,并消除紅霉素應用中的不利影響。供體菌、輔助菌和受體菌OD600為0.6時,將三者按體積比(mL)0.4∶0.4∶0.6比例混勻,用MRS培養基洗滌混合菌2次,涂布于含0.005%(W/V)錐蟲藍、1%可溶性淀粉、0.1 mol/L CaCl2的MRS平板中,培養5 h后用1 mL含5 mg/L的Amp、50 mg/mL萘啶酮酸的水溶液覆蓋,培養至72 h,平板上長出藍色菌落。通過表達6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因的重組菌,甘露醇產量比原始菌提高了約7%。

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Study on application ofα-amylase gene in the gene expression ofLeuconostocmesenteroides

TIAN Yun-fei,LIU Xiao-li,CHENG Wen-yu,JIN Hong-xing*

(School of Chemical Engineering & Technology,Hebei University of Technology,Tianjin 300130,China)

Objective:To verify the effect of theα-amy(α-amylase gene)used inLeuconostocmesenteroides,construction of recombined plasmid and triparental mating system inLeuconostocmesenteroideswere performed. Methods:The recombined plasmid pCW7,containingα-amy,was constructed based onE.coli-Leuconostoc shuttle vectors pCW4. 6-Phosphoglucose dehydrogenase gene(g6ph)expression cassettes fromLeuconostocmesenteroidesATCC8293 was cloned into pCW7 and introduced intoLeuconostocmesenteroidesby triparental mating. Results:Compared with the wild type,the recombination strain increased 7% yield of mannitol. The recombinant can be successfully selected byα-amylase gene markers. Conclusion:It showed the practicability ofα-amylase gene markers used in improving the gene expression ofLeuconostocmesenteroides.

Leuconostocmesenteroides;α-amylase gene;triparental mating;6-Phosphoglucose dehydrogenase

2015-11-30

田云飛(1989-)，女，碩士，研究方向：細菌遺傳育種學，E-mail：tian_yunfei@163.com。

金紅星(1968-)，男，博士，副教授，研究方向：細菌遺傳育種學，E-mail：jinhx87@126.com。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0203-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.033