原料藥國際注冊中基因毒性雜質的法規解讀

王睿睿

摘 要 遺傳毒素是一類極富挑戰性的雜質，并已被證明即便在低濃度條件下依然具有毒性。因此美國和歐盟的藥品監管機構以及人用藥品注冊技術要求國際協調會（ICH）都特別指定了它們在原料藥和成品藥中的限量。通過解析原料藥在美國和歐盟注冊中涉及到的關于基因毒性雜質控制的法規，為中國制藥企業提供相關技術指導以推動中國藥品出口事業的增長。

關鍵詞 原料藥 雜質 基因毒性

中圖分類號：R951 文獻標識碼：C 文章編號：1006-1533（2016）15-0063-05

Introduction to regulations for genotoxic impurities in API registration

WANG Ruirui*

（Spectrum China Ltd.， Shanghai 201611， China）

ABSTRACT Genotoxic toxin is a very challenging impurity， which has been proved to be toxic even at low level. Thus ICH and other competent authorities in US and EU have established limitation for genotoxic impurities in active pharmaceutical ingredients （API） and finished dosage form. The US and EU regulations concerned with genotoxic impurities are elaborated so as to provide some technical advices for Chinese drug manufacturers and make progress for the business of drug exportation.

KEY WORDS active pharmaceutical ingredients （API）； impurity； genotoxicity

1 藥品中的雜質的定義及分類

藥品中的雜質定義為無任何療效、且可能引起副作用的物質。因此，必須控制雜質水平，以確保藥品的安全性達到人用要求。雜質會影響藥品的安全性和研發時間，例如，藥物開發中，如果必須采用多種手段進行雜質表征，并將其去除至可接受水平，所需時間將會顯著增加。根據人用藥品注冊技術要求國際協調會（ICH）指南，原料藥相關的雜質可分為三個主要類別：有機雜質、無機（元素）雜質以及殘留溶劑。在這三類中，遺傳毒性雜質是一種特例，既便在低濃度條件下也有著重大的安全風險。這是因為它們可能具有致突變性，可能導致DNA損傷，從而增加罹患癌癥的風險。

原料藥中的雜質來源包括以下幾個方面：①原料及其污染物；②試劑和催化劑；③溶劑；④中間體；⑤降解產物；

為保護患者，需要將藥物的雜質水平降到可接受的安全限度內，因此各國都已相繼制定了雜質控制指南，這些指南都專注于利用規定限度控制藥品中的雜質含量，其中由ICH與美國食品藥品監督管理局（FDA）制定的指南較權威且影響大。例如，ICH Q3A通過制定雜質的報告、鑒定和認證閾值以監管新原料藥中的雜質[1]。ICH Q3B是其同等的新藥雜質指南[2]。ICH Q3C和 ICH Q3D分別控制殘留溶劑與重金屬元素雜質的限量[3-4]。

已經正式生效的ICH M7是ICH專家工作組制定的一本關于藥物中DNA反應性雜質的指南[5]，包括如何根據結構活性分析來評估藥品中雜質的潛在基因毒性，如何確定關鍵毒性閾值（毒性關注閾值TTC）。此外，還論述了一些特別復雜的問題和情景，例如，為什么潛在基因毒性物質具有相似的分子結構，可能相同的反應機理還不能合并用于TTC的計算。另一個問題是指南試圖對不同TTC值進行澄清，這依賴于使用藥品的時間長度。

2 基因毒性雜質的定義

ICH S2（R1）指南中，將遺傳毒性定義為“一個廣泛的術語，指的是遺傳物質中的任意有害變化，而不考慮誘發該變化的機制” [6]。而遺傳毒性雜質定義為“經過適當遺傳毒性試驗模型，例如，細菌基因突變（Ames）試驗，證實具有遺傳毒性的雜質”。潛在遺傳毒性雜質（potential genotoxic impurity）定義為“具有遺傳毒性警示結構的雜質，但未經實驗測試模型驗證” [7]。

3 有關基因毒性雜質的研究

3.1 在基因毒性雜質來源方面的研究

Szekely等[8]提供了較詳細的分析，列出了具有基因毒性行為的警示結構及與其有關的各種化學反應，這些反應被現代的制藥開發及生產廠商普遍使用。同時還將這些基因毒性雜質按照化學反應中起到的不同作用進行分類：①來源于反應物的結構有鹵代烷、二羥基硫酸鹽、環氧化合物、肼、四甲基哌啶氧化物、芳香胺、硼酸；②來源于副反應的結構有：磺酸酯、鹵代烷、乙酰胺。

3.2 在基因毒性雜質分析方面的研究

Liu等[9]報道了關于藥物中遺傳毒性雜質痕量分析的研究進展。這篇文章從行業角度闡述了化學品開發中經常遇到的不同結構類型遺傳毒性雜質的分析。

Elder等[10]描述了活性藥成分（API）和藥品中肼類、酰肼類和腙類遺傳毒性雜質的分析。尤其值得注意的是其中使用了多種技術，包括色譜和光譜，且樣品大多進行了衍生化處理。

Elder等[11]報道了API 中芐基鹵類及其它相關活性有機鹵化物等潛在遺傳毒性雜質的分析，并對分離技術進行了分類，包括配有不同檢測器（質譜等）的氣相色譜和高效液相色譜，以及薄層色譜和毛細管電泳。

3.3 在基因毒性雜質去除方面的研究

Robinson[12]提出了一些遵守監管指南的控制策略，并對每種方法進行舉例說明：①重新設計原料藥合成途徑，以避免引入有問題的雜質；②修改相關工藝參數，以去除此類雜質或將其降低至不顯著的水平；③加深工藝理解，以證明特定的遺傳毒性雜質不會生產或可被有效去除；④進行毒性研究，以論證可以雜質在設定的低濃度下不具有危害性。Szekely等[8]提出了在很多實際情況下，具有反應活性和合成用途的反應物及中間體很可能會與DNA發生反應，而且這類化合物在藥物開發階段很難避免使用以控制或者降低基因毒性雜質，尤其是在工藝放大的階段更難實現，因此，目前普遍采用的策略為對基因毒性雜質的預防，即關于除去或者降低關鍵合成步驟中的基因毒性雜質的濃度。他們還分別從兩個方面討論去除基因毒性雜質的方法：①改變合成反應條件，包括改變反應組分的比例；變換反應組分的添加順序；改變起始物料的質量或者制備方法；采用質量源于設計的理念控制基因毒性雜質等；②優化API純化過程，包括調整諸如反應度、溶解度、蒸發度和電離度等沖洗因子和分離技術。

4 基因毒性雜質研究指南

業界和各國的監管機構都已制定了特別針對遺傳毒性雜質的指南（表1）

其中與原料藥注冊密切相關的指南為①PhRMA意見書；②EMA雜質限度及其問答指南；③FDA行業指南（草案）；④ICH M7。

4.1 PhRMA意見書

2004年PhRMA成立了一個工作小組來討論遺傳毒性雜質，成果以意見書的形式公開發表[13]。

由于這份意見書的制定和EMA相關官方指南的制定舉措同時進行，結果導致方法有部分重疊。例如PhRMA文件使用了EMA草案中毒理學關注閾值（TTC）的概念，而EMA最終版指南中推薦了由PhRMA工作小組提出的分期TTC方法。因此，這兩個文件在方法和側重點上互為補充。

PhRMA文件引入了兩個重要的創新理念：

1）遺傳毒性雜質的五級分類系統 ①已知具有基因毒性（突變性）和致癌性的雜質，包括已知的動物致癌物和人類致癌物，其遺傳毒性機制有可靠數據支持。雜質的遺傳毒性本質可由已發表的化學結構數據加以證明。②已知具有基因毒性（突變性），但致癌性未知的雜質，包括基于常規遺傳毒性試驗證實有致突變性的雜質。③具有警示結構，但與API結構無關，同時和具有未知的基因毒性（突變性）潛力的結構也無關，包括功能基團結構與遺傳毒性相關的雜質。然而，這些基團還未作為單獨化合物進行檢驗，而是基于其化學結構和使用基礎知識的構效關系（SAR）專家系統對其進行鑒定。這些警示性的功能基團不存在于API的結構中。有一些結構被廣泛認為具有與DAN反應的活性，如致突變作用。Müller等[13]提出的能與DNA發生反應的一些警示結構（圖1）。④含有與API相關的警示結構及與API結構相同的警示功能基團的雜質。⑤無警示結構或未表現潛在遺傳毒性。迄今為止，這項策略已基本上成為業內大多遺傳毒性雜質相關風險評估的標準。

2）臨床實驗材料的分期TTC概念 分期TTC意味著可以根據劑量和臨床試驗的持續時間對其進行調整，使得劑量增加時TTC降低，持續時間較短時TTC提高（表2）。根本原因在于臨床試驗的用藥持續時間有限，且總體暴露量相對較低。初始TTC保守的風險評估意味著該方法對絕大多數物質（強致癌物質除外）具有很高的安全系數。分期TTC值應適用于開發中的所有階段以及每一個化合物，以防多種遺傳毒性雜質同時存在。這個概念的一個例外是強效致癌物。

兩個概念的引入旨在為行業在新藥開發階段提供一些靈活性和風險減輕策略。同時，分期TTC方法也是EMA和FDA遺傳毒性雜質指南的一個基本要素[7，14-15]。

4.2 EMA指南

EMA作為監管機構先驅，推行了處理遺傳毒性雜質的詳細指南。制定草案的任務由專利藥品委員會（CPMP），如今稱為人用藥品委員會（CHMP）的安全工作組（SWP）承擔。SWP委員會認為具有潛在遺傳毒性的雜質是一個特例，沒有涵蓋在Q3A和Q3B指南中，因此當初為了彌補ICH指南中雜質控制部分的空缺，特別是針對那些可能異常強效的潛在雜質，例如潛在遺傳毒性雜質。委員會建議在ICH限度中加入基于風險的安全因素，這與Q3C中使用的殘留溶劑方法類似。為征詢公眾意見，在2002年發表第一版草案，標題為遺傳毒性雜質限度意見書。并在2004年發表完整版。從這次發表以后，歐洲藥品管理局的官方縮略名由EMEA變更為EMA。2006年6月，EMA的CHMP發布了遺傳毒性雜質限量指南的最終版。CHMP安全工作組發布了一些問答文件進一步解釋說明，極大地完善了該指南。文件適用于新原料藥中的遺傳毒性雜質，也適用于一些現有活性物質的新應用，在這些應用中，與已獲得授權的含有相同活性物質的產品相比，其合成路線、工藝控制和雜質分析的評估不能合理保證未引入新的或更高水平的遺傳毒性雜質。在目前情況下將一個化合物歸類為遺傳毒性物質，一般意味著以可能直接損傷DNA的物質為重點的體外或體內遺傳毒性試驗，得出了陽性結果。并在充分的后續試驗中，評估了獨立的體外實驗結果與體內試驗結果的關聯性。

指南建議將遺傳毒性雜質分為具有充分（試驗）證據證明其閾值相關機理的雜質和無充分（試驗）證據證明其閾值相關機理的雜質。并建議將相關實驗限定于特定雜質，這些雜質基于化學反應知識、分子結構、原材料中的雜質類型和含量，以及現有的遺傳毒性數據，可合理預測其具有遺傳毒性。

具有充分證據證明其閾值相關機理的遺傳毒性數據雜質將按照ICH Q3C（R3）中的2類溶劑的方法進行處理。該方法計算“每日允許暴露量（PDE）”。根據最相關動物研究中的“未觀察到的作用的劑量”或替代性的“觀察到最低作用的劑量”，并結合多種不確定因素所得。

4.3 FDA指南草案

2008年12月，美國FDA發布了行業指南草案，原料藥和成品藥中的遺傳毒性和致癌性雜質-推薦方法。FDA指南針對已知或可疑的潛在遺傳毒性和致癌雜質的安全認證提供了具體建議。指南描述了許多用以表征及減少患者暴露于遺傳毒素和致癌性雜質導致的潛在癌癥風險的方法。這些方法與EMA指南相似，包括三個步驟：①改變合成和/或純化路線，使相關雜質生產最少，和/或最大程度去除相關雜質；②將相關雜質的日最大暴露指標1.5 mg作為總體目標；③進一步表征遺傳毒性和致癌性風險，以更好地支持適當的雜質限量指標，無論是上限值還是下限值。

FDA指南使用與EMA指南相同或相似的方法；但是，他們也有一些關鍵區別（表3）。

4.4 ICH M7

已經生效的ICH M7 題為：ICH M7為限制在藥物中具有DNA活性（誘變性）雜質進行的評估和控制以限制潛在的致癌風險。該指南與現行的EMA指南相似，特別是警示結構、Ames試驗、TTC概念的應用及風險評估的相關部分。此外，它還討論了其他問題，例如怎樣處理具有相似作用機理的多種結構相關遺傳毒性物質，以及在計算TTC時是否應對它們求和。

5 結論

以上是原料藥在美國和歐盟注冊中所涉及到的關于基因毒性雜質控制的法規，在實際申報注冊中，申請人應該指明涉及到的所有具有基因毒性或有致癌性的化學物質，如所用試劑、中間體、副產品等。制藥企業應該根據現有的生產技術，采用合理的生產方法。如果在合成路線、起始物料方面沒有更好的選擇，則需要提供一個正當的理由，就是物質中能引起基因毒性和致癌性的結構部分在化學合成是不可避免的。

假如基因毒性雜質被認為是不可避免的，那么應該采取技術手段盡可能地減少基因毒性雜質在產品中的含量，使其符合安全的需要或使其降低到一個合理的水平。對于活性中間體、反應物、以及其它化合物的化學穩定性都應該進行評估。并采用合理的分析方法去檢測和量化這些雜質的殘留量。

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