不同生長年限白芍中主要成分含量的比較研究

馬福家+倉婕+孔銘+李松林

摘 要 目的：比較不同生長年限的白芍中主要成分含量，為白芍規(guī)范化種植、采收提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用HPLC法測(cè)定白芍中沒食子酸、氧化芍藥苷、 芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸與1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖含量。結(jié)果：隨著生長年限的增加，沒食子酸和苯甲酸含量逐年下降，而芍藥苷、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖含量卻逐漸增加。結(jié)論： 4～5年生的白芍有效成分含量最高，適宜采收。

關(guān)鍵詞 白芍 HPLC 種植年限

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2016）15-0075-05

Comparison of the contents of major ingredients in Radix paeoniae alba with different growth phases

MA Fujia1*， CANG Jie1**， KONG Ming 2，3， LI Songlin 2，3（1. Department of Pharmacy， No. 455 Hospital of PLA， Shanghai 200052， China； 2. Nanjing Integrated Traditional Chinese Western

Medicine Hospital， Nanjing 210028， China； 3. Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine， Nanjing 210028， China）

ABSTRACT Objective： To compare the contents of major ingredients in Radix paeoniae alba with different growth phases. Methods： The contents of gallic acid， oxypaeoniflorin， albiflorin， peoniflorin， benzoic acid and 1，2，3，4，6-pentagalloylglucose from Radix paeoniae alba with 2～ 5 years of growth phases were determined by HPLC so as to provide a scientific evidence for the planting and harvest of Radix paeoniae alba. Results： The contents of gallic acid and benzoic acid were gradually decreased while the contents of oxypaeoniflorin， albiflorin， peoniflorin and 1，2，3，4，6-pentagalloylglucose increased with the increase of its growth phase. Conclusion： The contents of active ingredients in Radix paeoniae alba with 4～5 years of growth phase are the highest， suggesting it is the most suitable time for harvest.

KEY WORDS Radix paeoniae alba； HPLC； growth phase

白芍為毛茛科植物芍藥（Paeonialactiflora pall）的干燥根，主產(chǎn)于安徽亳州、浙江磐安等地，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽的功效，可用于血虛萎黃，月經(jīng)不調(diào)，自汗，盜汗，脅痛，腹痛，四肢攣痛，頭痛眩暈[1]。白芍的主要活性成分為單萜糖苷類成分，如氧化芍藥苷、 芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷等，具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎等作用；沒食子酸類成分，如沒食子酸、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖等，具有明確的抗氧化、抗炎等作用[2]；酚類成分，如苯甲酸，通常被認(rèn)為是食品中的有害成分，但通過對(duì)苯甲酸累積規(guī)律的研究，可間接評(píng)價(jià)白芍的質(zhì)量[3]。白芍為多年生草本，一般夏、秋二季采挖。有文獻(xiàn)顯示，不同生長年限對(duì)白芍質(zhì)量存在影響[2-4]，但這些研究均以芍藥苷作為單一評(píng)價(jià)指標(biāo)，缺乏整體性。調(diào)研表明，白芍尚未明確具體的采收年限，但產(chǎn)地一般采挖生長周期為3～5年的白芍根，絕大多數(shù)市售白芍中芍藥苷的指標(biāo)均能滿足藥典芍藥苷含量不小于1.6%的要求[1]，但其活性成分隨著生長年限而變化的規(guī)律仍不清楚，還需深入探討。本研究通過建立白芍中6個(gè)主要活性成分含量測(cè)定的方法[3，5-9]，以此探討白芍主要活性成分含量和生長年限的相關(guān)性，為白芍規(guī)范化種植采收提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Waters 高效液相色譜儀（Alliance 2695 四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、柱溫箱、Empower色譜工作站、Waters 996二極管陣列檢測(cè)器）；Millipore Milli-Q超純水儀（美國）；Mettler 萬分之一及百萬分之一電子天平（瑞士）。

1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖和氧化芍藥苷購自四川維克奇生物科技有限公司；芍藥苷（110736 - 201337）和沒食子酸（110831 - 201204）購自中國食品藥品檢定研究院；芍藥內(nèi)酯苷自制，結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR和MS確證，純度經(jīng)HPLC測(cè)定大于98%；鮮白芍藥材購自安徽省亳州市五馬鎮(zhèn)，經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院鑒定為毛茛科植物芍藥（Paeonialactiflora pall ）的根。甲醇，乙腈為色譜純，其余均為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：Alltima C18（4.6 mm×250 mm，5 mm）柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%磷酸，梯度洗脫如下：0～20 min，A：5%～10%；20～40 min，A：10%～20%；40～50 min，A：20%～50%；流速：1 ml/min；進(jìn)樣量20 ml；檢測(cè)波長：230 nm。

1.3 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸和1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml含沒食子酸0.142 5 mg、氧化芍藥苷0.181 5 mg、芍藥內(nèi)酯苷0.849 0 mg、芍藥苷1.440 0 mg、苯甲酸0.165 0 mg和1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖0.813 0 mg的混合對(duì)照品母液。

1.4 供試品溶液的制備

取白芍鮮藥材，粉碎，取細(xì)粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 ml，超聲提取45 min，靜置，補(bǔ)足重量，取上清液微孔濾膜（0.45 mm）濾過， HPLC測(cè)定。另取適量白芍鮮藥材，按2015版《中國藥典》四部通則0832水分測(cè)定法第二法測(cè)定，藥材含量以扣除水分后的干品計(jì)算。

1.5 線性關(guān)系的考察

取混合對(duì)照品母液稀釋成不同濃度，各精密吸取20 ml，注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，記錄色譜峰面積。

1.7 精密度實(shí)驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 ml，計(jì)算其峰面積的RSD值；另取混合對(duì)照品溶液10 ml進(jìn)樣，每小時(shí)進(jìn)樣1 次，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù) 3 d 進(jìn)樣以上濃度的對(duì)照品溶液，每天進(jìn)3次，計(jì)算日間精密度。

1.8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取3年生鮮白芍藥材6份，按“1.3”項(xiàng)下確定的方法制備供試品溶液，計(jì)算沒食子酸，氧化芍藥苷，芍藥內(nèi)酯苷，芍藥苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖含量的RSD值。

1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取3年生鮮白芍藥材1份，按“1.3”項(xiàng)下確定的方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h依法測(cè)定，計(jì)算沒食子酸，氧化芍藥苷，芍藥內(nèi)酯苷，芍藥苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖峰面積的RSD值。

1.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱取已知含量的3年生白芍藥材6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別加入含0.25 mg/ml沒食子酸，0.12 mg/ml氧化芍藥苷，6.08 mg/ml芍藥內(nèi)酯苷，11.86 mg/ml芍藥苷，2.30 mg/ml苯甲酸，3.57 mg/ml 1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖對(duì)照品溶液0.8 ml，1.0 ml，1.2 ml各2份，按“2.3”項(xiàng)下的方法操作，依法測(cè)定，計(jì)算它們各自的回收率。

1.10 樣品含量測(cè)定

取不同生長年限的鮮白芍藥材，按1.3項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，每個(gè)樣品平行3份，計(jì)算沒食子酸，氧化芍藥苷，芍藥內(nèi)酯苷，芍藥苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖的含量。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件

在所列色譜條件下，供試品溶液中6個(gè)對(duì)照品與相鄰成分基本達(dá)到基線分離（圖1）。

2.2 線性關(guān)系的考察

以對(duì)照品濃度X與對(duì)應(yīng)的峰面積Y 作線性回歸，回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表1。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

沒食子酸，氧化芍藥苷，芍藥內(nèi)酯苷，芍藥苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖峰面積的RSD分別為1.9%、1.5%、1.7%、0.9%、1.2%、1.5%，表明儀器精密度良好；日內(nèi)精密度RSD（ n =6） 分別為1.3%、1.4%、2.0%、1.1%、1.3%、0.7%；日間精密度RSD （ n = 9） 分別為1.9%、1.9%、1.5%、0.7%、1.1%、0.9%。日內(nèi)、日間精密度RSD 均≤2.0%，表明該方法的日內(nèi)和日間精密度均良好。

2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

6份供試品溶液中沒食子酸，氧化芍藥苷，芍藥內(nèi)酯苷，芍藥苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖含量RSD分別為2.5%、2.6%、1.8%、2.2%、3.1%、2.9%，重復(fù)性結(jié)果良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

供試品溶液中沒食子酸，氧化芍藥苷，芍藥內(nèi)酯苷，芍藥苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖含量在12 h內(nèi)穩(wěn)定性RSD分別為3.1%、2.1%、2.8%、1.9%、2.2%、2.6%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

沒食子酸，氧化芍藥苷，芍藥內(nèi)酯苷，芍藥苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖的回收率及RSD見表2。

2.7 樣品含量測(cè)定

不同生長年限的鮮白芍藥材主要化合物含量（表3）。

3 討論

3.1 樣品采集

為避免不同種植地、不同采收時(shí)間存在的差異，本試驗(yàn)所用藥材為同一種植地、同一品種、同一采收時(shí)間的不同生長年限鮮白芍，以減少試驗(yàn)誤差。

3.2 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)中分別考察了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水3中不同的流動(dòng)相及其不同比例對(duì)6個(gè)主要化合物的分離效果，結(jié)果顯示，在乙腈-0.1%磷酸水條件下，采用選定的梯度洗脫條件可以達(dá)到6個(gè)成分基線分離，且分離度大于1.5。

3.3 檢測(cè)波長的確定

試驗(yàn)中采用了二極管陣列檢測(cè)器，在分析對(duì)照品的同時(shí)進(jìn)行了190～400 nm全波長紫外掃描，結(jié)果顯示沒食子酸，氧化芍藥苷，芍藥內(nèi)酯苷，芍藥苷，苯甲酸，1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖的最大吸收波長分別為278、258、230、230、230和278 nm。實(shí)驗(yàn)中分別提取258、230和278 nm下各樣品溶液的色譜峰進(jìn)行比較，結(jié)果在230 nm下的各成分峰形好，基線平穩(wěn)，各色譜峰之間的分離度高，故檢測(cè)波長選定為230 nm。

3.4 提取條件的確定

試驗(yàn)中設(shè)計(jì)比較了甲醇、70%甲醇回流提取和甲醇、70%甲醇超聲提取對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，回流提取可使沒食子酸含量明顯增加，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道沒食子酸和甲醇能在催化作用下形成沒食子酸甲酯[8]，因此，我們認(rèn)為回流提取由于加熱溫度過高，使得藥材中沒食子酸發(fā)生加成反應(yīng)，生成沒食子酸甲酯，故選定70%甲醇超聲提取。

另外，對(duì)超聲提取時(shí)間進(jìn)行了考察，分別比較了提取30、45 和60 min時(shí)6個(gè)化合物的含量及其總含量，結(jié)果顯示，在超聲提取45 min時(shí)6個(gè)化合物的含量已達(dá)最高，最終確定采用70%甲醇超聲提取45 min。所建的方法經(jīng)過方法學(xué)考察驗(yàn)證表明，該方法操作方便、穩(wěn)定、可行。

3.5 不同采收期對(duì)各成分含量的影響

實(shí)驗(yàn)中考察了從2年至5年不同生長年限的鮮白芍主要化學(xué)成分的含量。結(jié)果顯示沒食子酸和苯甲酸含量隨著生長年限的增加逐漸下降，尤其是苯甲酸含量從8.432 mg/g下降至0.785 mg/g。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道顯示苯甲酸主要分布于白芍外皮中，推測(cè)生長年限少的白芍較細(xì)，外皮所占重量比例較高，因此苯甲酸的含量較高，該研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道較一致[6]。白芍中的主要活性成分包括單萜糖苷類和沒食子葡萄糖類，其中含量較高的最主要化合物為芍藥苷、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖，這些化合物的含量隨著生長年限的增加而增加，均為5年生>4年生>3年生>2年生。中國藥典以芍藥苷為指標(biāo)控制白芍質(zhì)量，要求芍藥苷含量大于1.6%。從研究結(jié)果來看，2～5年生白芍芍藥苷含量從0.74%逐年升高至1.97%，而2年、3年生白芍芍藥苷含量均低于1.6%，尚未達(dá)到藥典要求，因此，為滿足藥典要求，白芍宜采挖4～5年生為主[9-10]。調(diào)研顯示產(chǎn)地一般于夏、秋二季采挖4～5年生白芍，洗凈，除去頭尾和細(xì)根，置水中煮沸后除去外皮或去皮后再煮沸、曬干。因此， 由于4～5年生的白芍有效成分含量最高，比較適宜采收。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)為確認(rèn)白芍最佳采收期提供了依據(jù)，便于更好地控制藥材的質(zhì)量。

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