一測多評(píng)法同時(shí)測定酸棗仁的多個(gè)成分含量

張秋紅于姍姍岳路路

（1濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 濟(jì)南250102；2山東中醫(yī)藥大學(xué)，250355）

一測多評(píng)法同時(shí)測定酸棗仁的多個(gè)成分含量

張秋紅1于姍姍1岳路路2

（1濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 濟(jì)南250102；2山東中醫(yī)藥大學(xué)，250355）

目的：建立一測多評(píng)法測定酸棗仁中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、白樺脂酸含量的方法，并驗(yàn)證該方法在酸棗仁中應(yīng)用的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。方法：以白樺脂酸為指標(biāo)，采用超高效液相色譜法（UPLC）計(jì)算斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B與白樺脂酸的相對(duì)校正因子，進(jìn)而用該校正因子計(jì)算其他3種成分含量；同時(shí)外標(biāo)法測定酸棗仁中4種成分含量，比較“一測多評(píng)”法所得結(jié)果與外標(biāo)法測得結(jié)果的相似度。結(jié)果：一測多評(píng)法和外標(biāo)法測得的酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、斯皮諾素含量的計(jì)算值和實(shí)測值之間的夾角余弦值分別為0.999 72，0.999 71和0.998 36，兩者相似度較好，沒有顯著性差異。結(jié)論：UPLC可以簡便、快速地測出酸棗仁4個(gè)成分含量，一測多評(píng)法適用于酸棗仁中4種有效成分的含量測定，相對(duì)校正因子可信。

一測多評(píng)；超高效液相色譜法；酸棗仁；斯皮諾素；酸棗仁皂苷A；酸棗仁皂苷B；白樺脂酸；含量測定

《中國藥典》2010年版中收載酸棗仁是鼠李科植物酸棗（Ziziphus jujuba Mill.var.Spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou）的干燥成熟種子。其味甘、酸，性平。歸肝、膽、心經(jīng)。養(yǎng)心安神，用于體虛多汗，津傷口渴，驚悸多夢，虛煩不眠［1-2］。常被用作鎮(zhèn)靜、安眠、益肝類藥品和相關(guān)保健食品的藥材之一。皂苷類、黃酮類、生物堿類等是酸棗仁的有效成分；而酸棗仁中皂苷類和黃酮類化合物是其鎮(zhèn)靜催眠的主要有效成分；酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B和斯皮諾素為酸棗仁的專屬性活性成分［3-4］；近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道白樺脂酸為酸棗仁中重要活性成分之一［5-6］；且《中國藥典》2010年版用兩種方法測定酸棗仁皂苷A和斯皮諾素含量效率較低。現(xiàn)有不少文獻(xiàn)建立了同時(shí)測定酸棗仁中多個(gè)成分的方法［7-8］。本研究以酸棗仁中主要成分酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B和斯皮諾素作為測定目標(biāo)，以白樺脂酸為內(nèi)標(biāo)物，建立靈敏、簡便的同時(shí)測定酸棗仁中酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、斯皮諾素和白樺脂酸的超高效液相色譜法（UPLC），以期為酸棗仁的含量測定及質(zhì)量控制提供依據(jù)［9-10］。

一測多評(píng)就是用價(jià)格便宜或制備簡單的對(duì)照品來實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)不易得到對(duì)照品的成分的同步測定。本研究采用一測多評(píng)法，以白樺脂酸對(duì)照品為內(nèi)標(biāo)物，同時(shí)測定酸棗仁中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B 4種成分的含量，并與外標(biāo)法實(shí)測值進(jìn)行比較，為酸棗仁的含量測定提供一種可供選擇的新方法。

1 儀器、試劑

高速萬能粉碎機(jī)（FW80，天津市泰斯特儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；電子天平（BSA224S-CW，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；Agilent 1200SL型高分離度快速液相色譜儀；Waters ACQUITY型超高效液相色譜儀。

斯皮諾素（批號(hào)：110869-201102，中國食品藥品檢定研究院，含量以90.7%計(jì)）；酸棗仁皂苷 A（批號(hào)：110734-200510，中國食品藥品檢定研究院，供薄層掃描含量測定用）；酸棗仁皂苷 B（批號(hào)：110814-200607，中國食品藥品檢定研究院，供薄層掃描含量測定用）；白樺脂酸（批號(hào)：111802-201001，中國食品藥品檢定研究院，供鑒別用）；乙腈、甲醇、磷酸為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為純凈水；酸棗仁（經(jīng)濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心鑒定為正品）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（50 mm × 4.6 mm，1.8 μm），Wates ACQUITY UPLC○RBEH C18色譜柱（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）；0.03%磷酸水溶液（B）；梯度洗脫：0～3.5 min，14.5% ～ 14.5%A；3.5～ 4 min，14.5% ～37%A；4～ 6 min，37%～ 37%A；6～ 6.5 min，37%～ 83%A；6.5～ 8 min，83%～90%A；8～8.5 min，90% ～100%A；8.5～ 9 min，100% ～14.5%A；9～ 12 min，14.5% ～ 14.5%A；流速1.0 mL/min；檢測波長204 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量1 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

各取斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B和白樺脂酸對(duì)照品適量，精密稱定為18.72，10.22，11.06，13.57 mg，置于同一個(gè)50 mL容量瓶中，加甲醇定容制成含斯皮諾素 374.4 μg/mL，酸棗仁皂苷A 204.4 μg/mL，酸棗仁皂苷B 221.2 μg/mL，白樺脂酸271.4 μg/mL的混合對(duì)照品溶液50 mL。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過四號(hào)篩）約 l g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚（60～ 90℃）熱回流4小時(shí)，棄去石油醚液，藥渣揮去溶劑，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入70%乙醇20 mL，加熱回流2小時(shí)，濾過，濾渣用70%乙醇5 mL洗滌，合并洗液與濾液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察精密吸取上述酸棗仁混合對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL分別置5 mL容量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按上述色譜條件項(xiàng)下進(jìn)樣，記錄峰面積，以各對(duì)照品濃度對(duì)峰面積積分值進(jìn)行回歸處理，得斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B和白樺脂酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表 1。

表1 線性回歸方程和線性范圍

2.4.2 精密度試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液1 μL連續(xù)進(jìn)樣6次記錄4個(gè)組分的峰面積。斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、白樺脂酸峰面積的 RSD分別為 0.492%，0.04%，0.779%，1.39%，表明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液1 μL分別于 1，2，3，4 d進(jìn)樣2次測定峰面積積分值，斯皮諾素、酸棗仁皂苷 A、酸棗仁皂苷 B、白樺脂酸穩(wěn)定性的 RSD分別為0.389%，1.27%，4.31%，4.22%，表明該試驗(yàn)在4天內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批酸棗仁粉末，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下制備供試品溶液6份，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、白樺脂酸含量的RSD分別為1.23%，0.105%，2.53%，1.35%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)取酸棗仁樣品約1 g，精密稱定9份，分別加入一定量對(duì)照品，按照“供試品溶液制備”項(xiàng)下制備高、中、低3個(gè)濃度的供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、白樺脂酸加樣回收率的平均RSD分別為97.32%，93.67%，91.28%，95.37%。

2.4.6 樣品含量測定取酸棗仁樣品，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄含量，每批樣品平行制備2份，平行進(jìn)樣2次以4個(gè)結(jié)果的平均值作為測定值，結(jié)果見表 2。

表2 酸棗仁中4種成分的含量測定結(jié)果　（%）

2.5 一測多評(píng)

2.5.1 方法原理成分的濃度在一定的范圍內(nèi)與檢測器響應(yīng)成正比。多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)以該藥某一典型組分（對(duì)照品易得到）為內(nèi)標(biāo)，通過該組分與其他組分之間的相對(duì)校正因子計(jì)算其他組分的含量［11］。

設(shè)樣品中含i個(gè)組分，

Wi/Ai=fi（i=1..2...k...m），

Ai——組分峰面積；Wi——組分濃度。

假設(shè)組分k是內(nèi)標(biāo)，則組分k與其他組分m之間的相對(duì)校正因子：

fkm=fk/fm=WkAm/WmAk①。

由①得出定量計(jì)算公式：

Wm=WkAm/fkmAk②。

Ak——內(nèi)標(biāo)物峰面積；Wk——內(nèi)標(biāo)物濃度。Am——其他組分m峰面積；Wm——其他組分m濃度。

2.5.2 相對(duì)校正因子經(jīng)調(diào)查得知，酸棗仁有效成分4個(gè)對(duì)照品以白樺脂酸最為便宜，選為內(nèi)標(biāo)物，依據(jù)公式②分別計(jì)算酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、斯皮諾素對(duì)白樺脂酸的校正因子［12］。

2.5.3 色譜柱及高效液相色譜儀考察取“2.4.1”項(xiàng)下稀釋至原來0.3倍混合對(duì)照溶液，分別進(jìn)樣5次，每次1 μL，考察2種高效液相色譜儀和2種色譜柱Eclipse Plus C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm），ACQUITYUPLC○RBEHC18（50mm×2.1mm，1.7μm）。結(jié)果見表3［13］。

2.5.4 色譜峰專屬性根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行待測組分色譜峰的定位，已知內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間以及色譜峰的峰形，就可以正確判斷出目標(biāo)峰的位置。結(jié)果見表4［14］。

2.5.5 樣品測定精密稱取6批酸棗仁藥材粉末，制備供試品溶液。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各 1 μL注入高效液相色譜儀測定。分別采用外標(biāo)法和一測多評(píng)法計(jì)算酸棗仁中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、白樺脂酸含量，結(jié)果見表 5。

2.5.6 比較研究一測多評(píng)方法與常規(guī)法用夾角余弦值方法比較常規(guī)的外標(biāo)法實(shí)測含量與一測多評(píng)計(jì)算的含量，證實(shí)一測多評(píng)方法用于多指標(biāo)成分含量測定的可靠性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

色譜柱及高效液相色譜儀考察結(jié)果，酸棗仁中組分保留時(shí)間及相對(duì)保留時(shí)間如表3。

根據(jù)公式②計(jì)算得到的酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、斯皮諾素對(duì)白樺脂酸的校正因子結(jié)果如表4。

用外標(biāo)法和一測多評(píng)法計(jì)算酸棗仁中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B含量比較如表5。

表3 酸棗仁中組分保留時(shí)間及其相對(duì)保留時(shí)間差

表4 酸棗仁中其他3組分對(duì)白樺脂酸的相對(duì)校正因子

表5 酸棗仁中有效成分的一測多評(píng)法與外標(biāo)法比較 （μg/mL）

本試驗(yàn)采用一測多評(píng)法和外標(biāo)法測得的斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B的計(jì)算值和實(shí)測值之間的夾角余弦值分別為0.999 72，0.999 71 和0.998 36，表明兩種方法測得含量沒有顯著性差異。

4 分析與結(jié)論

本研究用UPLC同時(shí)測定酸棗仁中的4種有效活性成分，使用單波長紫外檢測器，分離度好、出峰快，方便簡單、節(jié)省時(shí)間，可用于批量測定酸棗仁含量，為酸棗仁質(zhì)量控制提供依據(jù)。專屬性和校正因子問題是一測多評(píng)的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)酸棗仁4個(gè)成分在不同柱子和儀器上出峰時(shí)間有所變化，但其相對(duì)保留時(shí)間變化不大，所以利用相對(duì)保留時(shí)間能較好地解決專屬性問題。

本研究考察了不同的色譜柱和液相色譜系統(tǒng)對(duì)白樺脂酸和斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B之間相對(duì)校正因子的影響；比較了外標(biāo)法實(shí)測組分的絕對(duì)含量與一測多評(píng)法推算含量，以評(píng)價(jià)一測多評(píng)方法的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，進(jìn)而證明實(shí)驗(yàn)中得到的校正因子具有較高的可信度；通過計(jì)算可知一測多評(píng)法與外標(biāo)法測到的含量之間沒有顯著性差異，一測多評(píng)法可以在對(duì)照品缺省的情況下實(shí)現(xiàn)定量測定的要求。目前許多文獻(xiàn)對(duì)不同產(chǎn)地的酸棗仁藥材質(zhì)量做出研究評(píng)價(jià)，酸棗仁有效成分得到越來越清晰、簡便的分析，有待進(jìn)一步細(xì)致研究。

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Simultaneous Determination of 4 Components in Ziziphi Spinosae Semen by Multi-components Assay with a Single Marker

Zhang Qiuhong1，Yu Shanshan1，Yue Lulu2（1 Jinan Experimental Center for Drug and Food，Shandong Jinan 250102，China；2 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，250355）

Objective：To develop a multi-components assay with a single marker（QAMS）for determination of contents of spinosin，jujuboside A，jujuboside B and betulinic acid in Ziziphi Spinosae Semen，and verify its accuracy and scientificalness.Methods：Using betulinic acid as an index，the relative correlation factors（RCFs）of spinosin，jujuboside A and jujuboside B were calculated by UPLC and used for the calculation of the contents of the three components.Results：The cosine coefficient of contents of jujuboside A，jujuboside B and spinosin calculated by QAMS and by external standard method were 0.999 72，0.999 71 and 0.998 36 respectively，indicating good similarities with no significance.Conclusion：The four components in Ziziphi Spinosae Semen may be determined by UPLC simply and rapidly.QAMS may be used for the content determination of four components in Ziziphi Spinosae Semen，of which the RCFs are reliable.

Quantitive Analysise of Multi-components with a Single-maker（QAMS）；UPLC；Ziziphi Spinosae Semon；Spinosin；Jujuboside A；Jujuboside B；Betulinic Acid；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.09.004

2016-04-02）

張秋紅，女，碩士，副主任藥師。主要從事中藥質(zhì)量控制與研究。E-mail：zhangqh9886@163.com

于姍姍，女，碩士，主管藥師。主要從事中藥質(zhì)量控制與研究。通訊作者E-mail：yssyb@126.com