植物RNA病毒檢測技術研究進展

劉湘寧 戴良英 董錚

摘要 RNA植物病毒常用的檢測方法有生物學檢測法、電子顯微鏡技術、血清學方法和分子生物學方法等，對這些方法的應用及其特點的研究進展進行了相應的總結，以期能夠更好地運用這些方法，進行植物RNA病毒的檢測與研究。

關鍵詞 植物RNA病毒；檢測技術；研究進展

中圖分類號 S432.41 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）09-0150-03

Abstract Commonly detection methods of plant virus including biological assay，electronic microscopy，serological methods and molecular biology method. In this paper，the research progress of using and characteristics of these methods were summarized，in order to make better use of these methods，to detect and study plant RNA virus.

Key words plant RNA virus；detection technology；research progress

幾乎所有植物，包括糧食作物、蔬菜、果樹、經濟作物、花卉和一些經濟林木都在不同程度上受到病毒的侵染，而其中90%的植物病毒為RNA病毒。以前人們太重視病毒所帶來的影響，除非造成大面積的流行或毀滅性的損失。病毒所造成的損失不僅是產量上，同時也伴隨著質量的降低，無論是果實、葉片，還是工業所用材料的有效成分、花卉的商品價值等都受到嚴重的影響，降低其使用價值。因此，快速、靈敏、高效的檢測病毒的方法成為認識和研究植物病毒病的重要手段。目前，植物RNA病毒的檢測方法生物學檢測方法、血清學檢測法、分子生物學檢測法等，這些方法各有優點，為現代常用的植物病毒病檢測方法。現將這些方法的特點介紹如下。

1 生物學檢測法

又叫指示植物檢測法。1925年，James Johnson開始使用特殊的植物鑒定植物病毒[1]，植物RNA病毒一般都會有特別的鑒別寄主或者特定的指示植物。指示植物就是指能對某一種或某幾種病毒及類病毒產生特異反應，被感染后能很快的表現出特異癥狀的植物[2]。因為指示植物的不同，可以細分為草本植物檢測與木本植物檢測。草本植物檢測的植物如藜科、豆科、茄科以及葫蘆科等植物都具有明顯的指示作用，通常采用摩擦接種的方法進行檢測，在嚴格的防蟲隔離情況下進行摩擦接種，從而獲得可靠的檢測結果[3]。李春敏等利用黃瓜、南瓜等指示植物，對PDV、PNRSV在指示植物上的表現癥狀進行了檢測與研究，檢測出PDV。生物學檢測法操作簡單，準確程度較高，應用頗為普遍[4]。然而其特異性不太明顯，存在一種病毒侵染后出現多種癥狀或多種不同病毒侵染后只出現一種表現癥狀的的現象。植物檢測法檢測速度緩慢，靈敏度較差，侵染指示植物后大多需要1～2周才有表現癥狀，個別甚至需要1～3年，而且受到植物生長與季節的限制，寄主的選擇要求嚴格，維護植物的費用很高，特別的指示植物較難以得到。

2 電子顯微鏡檢測法

從20世紀40年代建立了電子顯微鏡技術，Kausche和Melcher首次在電鏡下看到TMV以來，電子顯微鏡技術已成為一種重要的植物RNA病毒鑒定和常規檢測手段。將感染病毒的植物組織制成電子顯微鏡檢查樣本通過電磁波源，利用電磁波的電子流，在電子顯微鏡下顯示病毒的形態、大小、內含體以及染病組織超微結構等，從而診斷出病毒的種類。1959年電鏡負染技術首次應用于病毒結構的研究，Brenner和Horne通過一些重金屬離子能在蛋白體四周沉淀，在電鏡下形成一個黑暗的背景，而蛋白體內部沒有金屬離子的沉積而形成一個清晰的亮區，使成型的圖像呈底片樣貌，因此稱為負染色技術[5]。通過不斷的發展和完善，電子顯微鏡檢測技術被廣泛應用并與其他技術相結合產生了新的方法，免疫電鏡技術就是其中的一種，目前免疫電鏡技術已應用于病害診斷、病原鑒定、機理研究等多項領域[6]。

電子顯微鏡檢測技術是一種能夠快速、靈敏而簡便地檢測出植物RNA病毒的方法，能夠通過觀察到病毒的結構、大小、形態、有無包膜等確定其種類。然而使用電子顯微鏡檢測，專業要求較高，對典型病毒的特點和不同病毒組的形態必須有所了解，而且檢測過程中易受到寄主內含物的影響而干擾結果。觀測樣本制作要求較高，操作技術復雜，對儀器設備有較高要求。

3 血清學檢測法

血清學檢測方法是利用抗原與抗體結合而產生的免疫學反應來進行植物RNA病毒的檢測，是一種常用的植物RNA病毒檢測方法。目前，國際上已制備有200余種植物病毒的免疫試劑[7]。我國已制備出30余種植物病毒的檢測試劑，用于植物病毒監測與檢疫的研究。

3.1 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法（ELISA），是一種將抗體抗原的免疫反應與酶的催化反應相結合，快速的檢測植物RNA病毒的方法。原理是將酶與抗原或抗體結合形成酶標物，通過化學反應使酶標物與相應的抗體或抗原產生反應，形成復體呈出顏色反應，檢測出目的病毒。抗原或抗體吸附于酶聯板，用酶標抗體或抗原與相應的抗原或抗體結合形成酶標復合體，復合體上的酶遇對應的反應底物時，使底物水解生成不溶的或可溶的有色物質。如果生成的是可溶的有色產物可用肉眼或比色計進行觀測，如果生成的是不溶的有色物質，可通過電子顯微鏡進行識別和定量分析。自Clark等[8]研究并報道出酶聯免疫吸附檢測病毒的理論方法以來，ELISA廣泛應用在植物病毒的檢測中。在酶聯免疫吸附原理的基礎上通過不斷地改進，形成許多與ELISA有關的檢測方法。根據酶標物是抗體或抗抗體及檢測時添加抗體、抗原的順序等，將ELISA分為直接ELISA（Direct ELISA）、間接ELISA（Indirect ELISA）、單克隆捕獲ELISA（Mac-ELISA）、三抗夾心ELISA（TAS-ELISA）、雙抗體夾心ELISA（DAS-ELISA）、A蛋白雙抗夾心ELISA法（PAS-ELISA）等。在植物RNA病毒的檢測中應用最多的是雙抗體夾心ELISA（DAS-ELISA）。

3.2 點免疫結合測定法

即點免疫結合測定技術（Dot Immunobinding Assay，DIBA）是在酶聯免疫吸附法的基礎上通過研究發展來的一種植物RNA病毒檢測技術，由Hawkes等[9]于1982年研究成功并建立。基本原理是通過酶標記抗體與吸附于硝酸纖維膜（簡稱NC膜）上的抗原發生特異性結合產生免疫復合體，加入相應的酶反應物后產生不溶的物質，在硝酸纖維膜上形成有色的斑點。而根據膜上有無斑點和斑點的顏色可以判斷免疫反應是否產生以及抗原多少。該技術的優點是通過硝酸纖維素膜取代酶聯板，從而保持了ELISA對病毒檢測的高靈敏度和強特異性，并且簡化了操作程序，使病毒的酶聯免疫吸附檢測更加簡單、快速、方便[10]。

3.3 膠體金標記檢測

膠體金標記檢測是通過用檸檬酸鈉將氯金酸離子還原為膠體狀金，膠體金顆粒在一定的條件下吸附抗體IgG（或A蛋白）分子，形成穩定的IgG（或A蛋白）-膠體金復合物。用膠體金顆粒檢測植物組織榨取物只需10 min，而靈敏度與ELISA相當。Pares和Whitecross于1982年首次研究膠體金標記的抗體檢測植物病毒技術，目前該技術已被不斷研究和改進。傅倉生等[11]研究制備出適于植物病毒的膠體金顆粒，并以此膠體金與A蛋白結合形成復合探針，檢測煙草花葉病毒。利用膠體金免疫電鏡技術胡東維等對郁金香雜色綜合癥病原進行了鑒定和檢測[12]。陳建平等[13]將膠體金免疫電鏡技術應用于感病植物汁液病毒的檢測，從而提高了抗體對病毒的捕獲能力。

4 分子生物學方法

相較于血清學方法，從分子水平來檢測病毒，具有更高的靈敏度，可以檢測到皮克（pg）甚至飛克（fg）級以下的植物病毒[14]，并且檢測的植物RNA病毒更加廣泛，特異性更強，對類病毒也可進行檢測，同時能夠進行批量樣本的檢測。近年來，分子生物學方法被廣泛地應用于各種植物病毒的檢測，成為檢測植物病毒的重要方法。

4.1 核酸雜交檢測法

根據核苷酸單鏈互補可以相互結合的原理，通過將病毒核酸單鏈制成探針以某種方式加上標記，檢測待測樣品中互補的核酸，通過帶有探針的雜交核酸來指示病原的技術，即為核酸雜交檢測技術。Kirkpatrick B C等[15]1987年首次通過葉蟬作為原始材料分離和克隆了西方X病病原體DNA，并創立了點雜交（Dot Blot）分析法用于病原體的檢測。而后國內的研究者將該項技術用于多種植物病毒的檢測，如劉凌鳳等[16]、孟 清等[17]、呂典秋等[18]。

4.2 PCR技術

聚合酶鏈式反應（PCR）是Kary Mullis等人于1983年在美國首先創建的一項體外擴增DNA的技術，利用模板DNA、脫氧核苷酸和引物在一定的條件下，通過DNA聚合酶的催化，體外合成擴增出特異的DNA片段。

4.2.1 反轉錄PCR（RT-PCR）。大多數植物RNA病毒需要以RNA為模板，在反轉錄酶的作用下逆轉錄合成cDNA再以cDNA鏈為模板進行PCR反應，這就是兩步法RT-PCR技術。魏梅生等[19]根據煙草線條病毒的外殼蛋白基因，設計了一對特異性引物，提取大豆病葉中的總RNA，反轉錄成cDNA后擴增PCR產物，通過載體克隆轉化到大腸桿菌中，獲得430 bp大小的目標片段，經序列測定，確認為煙草線條病毒的外殼蛋白基因的RNA片段。張俊祺等[20]根據煙草黃瓜花葉病毒各株系全基因組序列設計一對引物通過優化反應的條件，建立了一步法RT-PCR檢測煙草感染CMV病毒的方法，設計建立了特異性強、重復性好、靈敏度高的檢測試劑盒。沈建國等[21]采用一步RT-PCR建立了快速檢測水仙黃條病毒的方法。

4.2.2 多重RT-PCR（Multiplex RT-PCR）。多種植物RNA病毒的復合侵染，可以通過多重RT-PCR方法同時檢測多種病毒，在短時間內檢測大量樣本，提高檢測效率，降低檢測成本，而且檢測成本低，是其他檢測方法所不能比擬的。周國輝等[22]建立了CyMV和ORSV的多重RT-PCR檢測技術。PCR檢測技術靈敏、快速、特異性強，對比免疫學方法專一性和靈敏性都有所超越，是常用的常規植物RNA病毒檢測方法。僅用少量植物感病葉片提取總RNA，運用PCR技術就可靈敏地檢測到是否存在感染。現在操作快速、簡單、重復性好的PCR技術整個檢測完成的時間相較于ELISA法檢測所用時間大大縮短，而且減少了必須制備抗血清的限制。

4.3 基因芯片技術

基因芯片技術是一項高新技術最近迎來了迅猛的發展，是植物RNA病毒快速檢測技術的一個重要發展方向。該技術可同時并實時地檢測感染植物中的多種不同病毒，甚至通過探針可以區分不同的病毒亞株系，對于確定植株中由何種病毒感染非常適合，與其他的分子檢測技術相比，更加高效、準確、快捷[23]。賈 慧等[24]利用CMV、TMV和PVY的外殼蛋白基因保守序列，設計出2條探針，建立了從病毒侵染樣本中檢測到特異性識別信號并同時檢測多種病毒的基因芯片檢測方法，而這一方法的檢測靈敏度相較于多重PT-PCR方法更高，能更加快速而準確地檢測出植物RNA病毒。

4.4 雙鏈RNA技術

雙鏈RNA的提取在研究大多數為RNA病毒的植物病毒中是一個重要的手段[25]。Morris和Dodds首次將雙鏈RNA（dsRNA）技術應用于植物和真菌病毒的檢測研究中[26]。植物體中存在的核酸包括DNA和RNA，而DNA轉錄產生RNA存在時間短、片段長，dsRNA在理論上不存在于正常的植物體內，Morris和Dodds的研究結果表明，某些正常植物體內會存在一些低分子量的dsRNA（<1×106），但大分子量的dsRNA（>1.0×108）的出現與含植物RNA病毒的基因組有關，因而可以利用dsRNA檢測病毒病原物。大多數植物病毒基因組為單鏈ssRNA，病毒侵染寄主后通過寄主體內物質進行復制時，首先會產生一條與基因組RNA互補的鏈，配對形成雙鏈模板，即dsRNA前體。再通過互補鏈轉錄出子代基因組RNA，互補鏈與基因組RNA長度相同，可在寄主體內大量積累。某些植物病毒本身基因組為dsRNA，因而復制后會產生大量子代dsRNA基因組，而通過dsRNA的檢測就能準確地反應出寄主的感染。

dsRNA對DNase和RNase具有耐受性，因而在提取過程中可以使用DNase和RNase除去多余混雜的DNA和RNA。李 賀等[27]研究了草莓植株中病毒dsRNA對RNase和DNase酶的耐受能力。dsRNA對雙酶具有較高的耐受性，因而可以使用此方法得到較純的dsRNA，用于后續的檢測和研究。目前，dsRNA主要用于病毒病及病源鑒定、病毒分化株系的鑒定，以dsRNA為中介對病毒核酸序列進行研究、探針的制備和cDNA克隆的獲得和用于檢測病毒衛星RNA和亞基因組RNA，有待開發和利用。

5 結語

以上所敘述的植物病毒檢測方法，為現代檢測植物病毒的一些常規方法，目前我國對植物病毒病的研究和檢測仍然停留在實驗和研究之中，還沒有形成易于推廣、靈敏度更高、特異性更強、準確率更高的檢測技術和方法。相信隨著經濟的發展、科技的進步，分子生物學的發展，病毒檢測技術終將出現便于操作，具有高重復性，靈敏的植物病毒學檢測方法，并研制出用于植物病毒檢測多功能試劑盒。

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