山慈菇提取物對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡的影響

于林楠+翟宏穎

【摘要】 目的：研究山慈菇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法：采用MTT法檢測(cè)山慈菇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞抑制率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3的影響。結(jié)果：不同濃度的山慈菇提取物對(duì)HT29細(xì)胞增殖均有抑制作用，且抑制率呈時(shí)間、劑量依賴關(guān)系；山慈菇提取物干預(yù)后誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡（P<0.01）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；山慈菇提取物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減弱（P<0.05）。結(jié)論：山慈菇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞有明顯的促凋亡作用，其機(jī)制可能與上調(diào)Cyt-C、Bax、Caspase-3下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 山慈菇提取物；結(jié)腸癌HT29細(xì)胞；凋亡

【中圖分類號(hào)】R282.71 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）16-0017-03

Abstract：Objective To investigate the effects of Cremastra appendiculata extract on proliferation and apoptosis in human colon cancer HT29 cells.Methods Using the MTT assay to determine the cell inhibition rates on human colon cancer HT29 cells；the flow cytometry to determine the apoptosis rates；Western blot technology to determine the expressions of Cyt-C、Bcl-2、Bax and Caspase-3 protein.Results Cremastra appendiculata extract inhibited the human colon cancer HT29 cells in a time dependent and dose dependent manner. the apoptosis rates of the cells were increased after being cultured by Cremastra appendiculata extract； the expressions of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein were increased and the expression of Bcl-2 protein was decreased（P<0.05）.Conclusions Cremastra appendiculata extract can induce the apoptosis of HT29 cells by a mechanism that may be related to increase the expression of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein as well as decrease the expression of Bcl-2 protein.

Keywords：Cremastra Appendiculata Extract；Human Colon Cancer HT29 Cells；Apoptosis

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率逐年增高，隨著手術(shù)、放療、化療等的進(jìn)步，早中期結(jié)腸癌治療效果明顯提高，但對(duì)于中晚期、高齡及難手術(shù)患者缺少有效的治療方法。目前，越來越多的醫(yī)務(wù)科研工作者將目光投向天然動(dòng)植物的研究，從中尋找可以防治腫瘤的有效成分，日漸成為臨床抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[1-2]。山慈菇是常用的抗腫瘤中藥之一，為蘭科植物中杜鵑蘭、獨(dú)蒜蘭及云南獨(dú)蒜蘭的干燥假鱗莖，具有解毒、化痰、散結(jié)等功效，臨床上常以配伍用藥的形式應(yīng)用于各種腫瘤的治療，其中包括結(jié)直腸癌[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，山慈菇具有抗腫瘤細(xì)胞生長、抑制血管生成、抗炎以及影響造血系統(tǒng)等作用，但其抗腫瘤的作用機(jī)制尚未完全闡明[4]。研究擬探討山慈菇提取物對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡的影響，以期為山慈菇運(yùn)用于結(jié)腸癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱MCO-175（日本Sanyo公司）；流式細(xì)胞儀6HT2L（美國Guava Easy Cyte公司）；BX50顯微鏡（日本Olympus公司）；超凈工作臺(tái)VD1320（哈爾濱東聯(lián)技術(shù)開發(fā)有限公司）；高速冷凍離心機(jī)CR21（日本Hitachi公司）；凝膠成像儀及凝膠成像分析系統(tǒng) GelDOC2000（美國Bio-Rad公司）。

1.2 材料 山慈菇提取物（沈陽藥科大學(xué)植物化學(xué)教研室提供，純度為98 %。稱取50g山慈菇粉末先后加入500mL、400mL、300mL去離子水加熱，冷卻過濾，濃縮至200mL，加入95%乙醇冷藏洗滌，最后獲得干粉6g，使用培養(yǎng)基配置成所需要的濃度）。胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；RPMI1640 培養(yǎng)液（Gibco生物工程有限公司）；0.5%二甲基亞砜、MTT（DMSO，美國Sigma公司）；Annexin V/PI凋亡試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司），Cyt-C抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase-3抗體、β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（美國Santa Cruz公司）；吸附（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29置于56℃、30min 10%胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，留取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

【摘要】 目的：研究山慈菇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法：采用MTT法檢測(cè)山慈菇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞抑制率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3的影響。結(jié)果：不同濃度的山慈菇提取物對(duì)HT29細(xì)胞增殖均有抑制作用，且抑制率呈時(shí)間、劑量依賴關(guān)系；山慈菇提取物干預(yù)后誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡（P<0.01）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；山慈菇提取物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減弱（P<0.05）。結(jié)論：山慈菇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞有明顯的促凋亡作用，其機(jī)制可能與上調(diào)Cyt-C、Bax、Caspase-3下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 山慈菇提取物；結(jié)腸癌HT29細(xì)胞；凋亡

【中圖分類號(hào)】R282.71 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）16-0017-03

Abstract：Objective To investigate the effects of Cremastra appendiculata extract on proliferation and apoptosis in human colon cancer HT29 cells.Methods Using the MTT assay to determine the cell inhibition rates on human colon cancer HT29 cells；the flow cytometry to determine the apoptosis rates；Western blot technology to determine the expressions of Cyt-C、Bcl-2、Bax and Caspase-3 protein.Results Cremastra appendiculata extract inhibited the human colon cancer HT29 cells in a time dependent and dose dependent manner. the apoptosis rates of the cells were increased after being cultured by Cremastra appendiculata extract； the expressions of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein were increased and the expression of Bcl-2 protein was decreased（P<0.05）.Conclusions Cremastra appendiculata extract can induce the apoptosis of HT29 cells by a mechanism that may be related to increase the expression of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein as well as decrease the expression of Bcl-2 protein.

Keywords：Cremastra Appendiculata Extract；Human Colon Cancer HT29 Cells；Apoptosis

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率逐年增高，隨著手術(shù)、放療、化療等的進(jìn)步，早中期結(jié)腸癌治療效果明顯提高，但對(duì)于中晚期、高齡及難手術(shù)患者缺少有效的治療方法。目前，越來越多的醫(yī)務(wù)科研工作者將目光投向天然動(dòng)植物的研究，從中尋找可以防治腫瘤的有效成分，日漸成為臨床抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[1-2]。山慈菇是常用的抗腫瘤中藥之一，為蘭科植物中杜鵑蘭、獨(dú)蒜蘭及云南獨(dú)蒜蘭的干燥假鱗莖，具有解毒、化痰、散結(jié)等功效，臨床上常以配伍用藥的形式應(yīng)用于各種腫瘤的治療，其中包括結(jié)直腸癌[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，山慈菇具有抗腫瘤細(xì)胞生長、抑制血管生成、抗炎以及影響造血系統(tǒng)等作用，但其抗腫瘤的作用機(jī)制尚未完全闡明[4]。研究擬探討山慈菇提取物對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡的影響，以期為山慈菇運(yùn)用于結(jié)腸癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱MCO-175（日本Sanyo公司）；流式細(xì)胞儀6HT2L（美國Guava Easy Cyte公司）；BX50顯微鏡（日本Olympus公司）；超凈工作臺(tái)VD1320（哈爾濱東聯(lián)技術(shù)開發(fā)有限公司）；高速冷凍離心機(jī)CR21（日本Hitachi公司）；凝膠成像儀及凝膠成像分析系統(tǒng) GelDOC2000（美國Bio-Rad公司）。

1.2 材料 山慈菇提取物（沈陽藥科大學(xué)植物化學(xué)教研室提供，純度為98 %。稱取50g山慈菇粉末先后加入500mL、400mL、300mL去離子水加熱，冷卻過濾，濃縮至200mL，加入95%乙醇冷藏洗滌，最后獲得干粉6g，使用培養(yǎng)基配置成所需要的濃度）。胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；RPMI1640 培養(yǎng)液（Gibco生物工程有限公司）；0.5%二甲基亞砜、MTT（DMSO，美國Sigma公司）；Annexin V/PI凋亡試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司），Cyt-C抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase-3抗體、β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（美國Santa Cruz公司）；吸附（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29置于56℃、30min 10%胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，留取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

【摘要】 目的：研究山慈菇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法：采用MTT法檢測(cè)山慈菇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞抑制率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3的影響。結(jié)果：不同濃度的山慈菇提取物對(duì)HT29細(xì)胞增殖均有抑制作用，且抑制率呈時(shí)間、劑量依賴關(guān)系；山慈菇提取物干預(yù)后誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡（P<0.01）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；山慈菇提取物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減弱（P<0.05）。結(jié)論：山慈菇提取物對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞有明顯的促凋亡作用，其機(jī)制可能與上調(diào)Cyt-C、Bax、Caspase-3下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 山慈菇提取物；結(jié)腸癌HT29細(xì)胞；凋亡

【中圖分類號(hào)】R282.71 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）16-0017-03

Abstract：Objective To investigate the effects of Cremastra appendiculata extract on proliferation and apoptosis in human colon cancer HT29 cells.Methods Using the MTT assay to determine the cell inhibition rates on human colon cancer HT29 cells；the flow cytometry to determine the apoptosis rates；Western blot technology to determine the expressions of Cyt-C、Bcl-2、Bax and Caspase-3 protein.Results Cremastra appendiculata extract inhibited the human colon cancer HT29 cells in a time dependent and dose dependent manner. the apoptosis rates of the cells were increased after being cultured by Cremastra appendiculata extract； the expressions of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein were increased and the expression of Bcl-2 protein was decreased（P<0.05）.Conclusions Cremastra appendiculata extract can induce the apoptosis of HT29 cells by a mechanism that may be related to increase the expression of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein as well as decrease the expression of Bcl-2 protein.

Keywords：Cremastra Appendiculata Extract；Human Colon Cancer HT29 Cells；Apoptosis

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率逐年增高，隨著手術(shù)、放療、化療等的進(jìn)步，早中期結(jié)腸癌治療效果明顯提高，但對(duì)于中晚期、高齡及難手術(shù)患者缺少有效的治療方法。目前，越來越多的醫(yī)務(wù)科研工作者將目光投向天然動(dòng)植物的研究，從中尋找可以防治腫瘤的有效成分，日漸成為臨床抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[1-2]。山慈菇是常用的抗腫瘤中藥之一，為蘭科植物中杜鵑蘭、獨(dú)蒜蘭及云南獨(dú)蒜蘭的干燥假鱗莖，具有解毒、化痰、散結(jié)等功效，臨床上常以配伍用藥的形式應(yīng)用于各種腫瘤的治療，其中包括結(jié)直腸癌[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，山慈菇具有抗腫瘤細(xì)胞生長、抑制血管生成、抗炎以及影響造血系統(tǒng)等作用，但其抗腫瘤的作用機(jī)制尚未完全闡明[4]。研究擬探討山慈菇提取物對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡的影響，以期為山慈菇運(yùn)用于結(jié)腸癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱MCO-175（日本Sanyo公司）；流式細(xì)胞儀6HT2L（美國Guava Easy Cyte公司）；BX50顯微鏡（日本Olympus公司）；超凈工作臺(tái)VD1320（哈爾濱東聯(lián)技術(shù)開發(fā)有限公司）；高速冷凍離心機(jī)CR21（日本Hitachi公司）；凝膠成像儀及凝膠成像分析系統(tǒng) GelDOC2000（美國Bio-Rad公司）。

1.2 材料 山慈菇提取物（沈陽藥科大學(xué)植物化學(xué)教研室提供，純度為98 %。稱取50g山慈菇粉末先后加入500mL、400mL、300mL去離子水加熱，冷卻過濾，濃縮至200mL，加入95%乙醇冷藏洗滌，最后獲得干粉6g，使用培養(yǎng)基配置成所需要的濃度）。胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；RPMI1640 培養(yǎng)液（Gibco生物工程有限公司）；0.5%二甲基亞砜、MTT（DMSO，美國Sigma公司）；Annexin V/PI凋亡試劑盒（南京凱基生物技術(shù)有限公司），Cyt-C抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase-3抗體、β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（美國Santa Cruz公司）；吸附（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29置于56℃、30min 10%胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，留取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。