枸杞多糖對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其抗氧化應激的機制研究

葛建彬，　盧紅建，　宋新建，　李　梅，　陳丹丹，　吳　鋒

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枸杞多糖對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其抗氧化應激的機制研究

葛建彬1，2，盧紅建1，宋新建1，李梅2，陳丹丹3，吳鋒3

目的探討枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBP)對缺血再灌腦損傷小鼠的保護作用及其可能的機制。方法通過頸總動脈栓線造成大腦中動脈缺血，缺血2 h后將栓線拔出以實現大腦中動脈血流再灌注，形成小鼠短暫性大腦中動脈阻塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)模型，觀察LBP(25 mg/kg，50 mg/kg和100 mg/kg)對小鼠腦梗死范圍，腦含水量，神經癥狀的影響，采用Westernblot法檢測缺血大腦皮質NOX4蛋白的表達，采用DHE染色法檢測腦組織中ROS的生成，采用分光光度計檢測缺血側腦組織勻漿SOD活力，GSH-Px活力，及MDA含量。結果LBP對缺血再灌注小鼠神經癥狀有明顯的改善作用，能明顯降低腦梗死范圍和腦含水量。Westernblot結果顯示：小鼠缺血再灌后，缺血側大腦皮質NOX4蛋白水平明顯增高，LBP能顯著降低NOX4蛋白水平。DHE染色顯示，LBP能顯著降低缺血再灌后ROS的生成。LBP能升高SOD和GSH-Px活力，降低MDA含量。結論LBP對缺血再灌注小鼠腦損傷有明顯保護作用，該作用可能與其抑制腦缺血再灌注引起的氧化應激損傷有關。

枸杞多糖；腦缺血；氧化應激；NOX4；ROS

腦梗死(cerebralischemia，CI)，是臨床常見病和多發病，具有極高的病死率和致殘率，且近年來有年輕化的趨勢，在發展中國家是第二或第三位導致個體死亡的原因，嚴重危害人類健康[1]。

枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBP)是從茄科植物枸杞的成熟果實中提取而得的一種水溶性蛋白雜多糖，是枸杞的主要活性成分之一，具有調節免疫、抑制腫瘤、延緩衰老、降血脂、降血糖等多種藥理作用[2]。最近Gao等[3]的研究表明，LBP通過調節海馬神經元的凋亡和再生，從而提高腦外傷大鼠的認知能力；Yang等[4]亦報道，LBP通過保護血腦屏障對腦缺血再灌注引起的腦損傷產生保護作用，提示LBP在神經系統損傷中可能發揮重要作用。本實驗采用線栓法建立小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，觀察LBP對腦缺血再灌注損傷的保護作用及對氧化應激的影響，以探討其治療缺血性腦卒中的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康6周齡ICR小鼠，清潔級，雄性，體質量20～25 g，由南通大學實驗動物中心提供。

1.2藥物與試劑枸杞多糖(LBP，寧夏沃福百瑞生物食品工程有限公司)；尼莫地平注射液(拜耳醫藥)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，國藥集團化學試劑有限公司)；NOX4(CellSignalingTechnology公司)；β-actin(Sigma公司)；SOD，GSH-Px，MDA試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.3主要儀器體視顯微鏡(SZM45，寧波舜宇)，UV-2501PC紫外可見分光光度計(日本島津)，電子天平(AL104，Mettler-Toledo公司)，超聲細胞破碎儀(Sonics&Meterials公司)，蛋白定量儀(Biorad公司)，電泳儀(powerPAC2000，Biorad公司)，共聚焦熒光顯微鏡(C1SL，Nikon公司)，離心機(MicroCL21R，ThermoScientific，德國)。

1.4實驗分組將實驗小鼠隨機分為6組，每組30只，分別為假手術組、MCAO模型組、LBP大劑量組(100 mg/kg)、LBP中劑量組(50 mg/kg)、LBP小劑量組(25 mg/kg)和尼莫地平組(4 mg/kg)組。各組動物腹腔注射給藥，1次/d，連續7 d，末次給藥1 h后進行手術。假手術組和模型組每次注射等量生理鹽水，其余實驗步驟與LBP干預組相同。

1.5小鼠腦缺血再灌注損傷(MCAO)模型的制備參考Longa等[5]的方法，制備小鼠腦缺血再灌注模型：用4%水合氯醛(350 mg/kg)將小鼠腹腔注射麻醉，仰臥位固定，注意保持呼吸通暢。酒精棉球頸部消毒，用手術剪沿頸中打開1 cm左右的切口。在體視顯微鏡下鈍性分離下頜下腺，游離右側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，頸總動脈上用一絲線扎緊。在頸外動脈與頸總動脈分叉處用絲線打一松結，將頸外動脈遠端用絲線結扎，用一燒紅的手術鑷將頸外動脈熔斷游離；用絲線將頸內動脈扎緊，用顯微眼科手術剪刀將頸外動脈剪一小孔，將線栓通過小孔向下插入至頸外動脈，松開頸內動脈上的線結，將線栓緩慢向頸內動脈方向插入，直至感到阻力時即止，為防止出血，將頸外動脈上線結扎緊。頸部傷口常規縫合。缺血2 h后，將線栓拔出，使動脈血重新流通24 h。假手術組手術步驟同前，不插入線栓。術后將動物置于室溫25～28 ℃，自由飲水、進食。

1.6神經癥狀評分小鼠腦缺血再灌注24 h后，采用Longa(0-4分)5分制[5]對小鼠的神經功能缺損進行評分：0分：活動正常，無神經功能障礙者；1分：左前肢不能完全伸直；2分：爬行時向左轉圈者；3分：爬行時向左側傾倒；4分：意識喪失，不能行走者。

1.7腦梗死體積的測定小鼠腦缺血再灌注24 h后，斷頭取腦，迅速置于-20 ℃冰箱中冷凍20 min后取出，去除嗅球、小腦和低位腦干，在操作臺上將腦組織由前向后行2.0 mm厚的連續5片冠狀切片，將腦片置于1%的TTC(0.1 ml，1 mol/L KH2PO4)磷酸鹽緩沖液中，37 ℃避光溫浴30 min。用掃描儀按順序掃描染色后的腦片，采用計算機軟件系統測量腦梗死面積，并計算腦梗死區占大腦總體積的百分比。

1.8腦含水量測定小鼠腦缺血再灌注24 h后，快速斷頭取腦，稱取左右大腦半球濕重，置于電熱恒溫干燥箱中110～115 ℃烘烤至恒重，稱取干重。計算腦含水量，計算公式為：含水量=(濕質量-干質量)/濕質量×100%。

1.9WesternBlotting檢測將取好的小鼠大腦缺血側皮質組織置于0.8 ml細胞裂解液中，低溫下超聲勻漿。離心機中12000 r/min、4 ℃離心10 min，分取上清液，置于-20 ℃冰箱中保存備用。取上述處理過的1 μl溶液，采用BCA法測定各組蛋白含量，用配置好的細胞裂解液按比例調整蛋白濃度。樣品中加入上樣緩沖液，混合均勻后于95 ℃變性處理5 min。上樣，安排β-actin參照，SDS-PAGE電泳，電壓110 V，分離蛋白質。電泳結束后，取出凝膠置于轉移緩沖液中平衡，凝膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。轉膜結束后，用TBST溶液洗膜，常溫封閉1 h。封閉結束后，TBST溶液洗膜，將膜放入塑料袋中，按0.1 ml/cm2加入一抗溶液(NOX4，β-actin，1∶1000，5%脫脂牛奶溶液)，混勻后將塑料袋中的氣泡去除，用封膜機封口，置于4 ℃中過夜。次日取出硝酸纖維素膜，用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。在膜上加入熒光二抗(1∶20000，用5%脫脂牛奶稀釋)，室溫下雜交爐中輕輕振蕩1 h，取出膜，PBS溶液中洗膜3次，每次10 min。用Odyssey Western Blot機器掃描獲取Western條帶圖片。

1.10DHE染色法檢測腦組織中ROS配置染色工作液：將染色液(ReagentB)置入冰槽里融化，稀釋液(ReagentC)置于室溫預熱。吸取500 μl染色液(ReagentB)至1.5 ml離心管，再加入500 μl稀釋液(ReagentC)，混合均勻，避光放置。小鼠腦組織用冰凍切片機切成20 μm厚的腦片，加上20 μl預冷的清理液(ReagentA)，鋪滿整個切片表面。小心移去切片上的清理液(ReagentA)，加上20 μl室溫預熱的染色工作液，鋪滿整個切片表面，置于37 ℃培養箱里孵育20 min。小心移去切片上的染色液，加上20 μl清理液(ReagentA)，小心移去切片上的清理液(ReagentA)，封片。激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察和攝片。

1.11腦組織SOD、GSH-Px及MDA的測定小鼠腦缺血再灌注24 h后，將各組小鼠斷頭處死，快速于冰浴上取出全腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，將小鼠缺血側腦組織以冰水預冷的生理鹽水制成10%腦組織勻漿。按照試劑盒說明書方法，分別測定SOD活力、GSH-Px活性及MDA含量。

2　結　果

2.1LBP對腦缺血再灌注小鼠腦梗死范圍的影響缺血再灌24 h后，假手術組小鼠腦組織沒有梗死灶，與假手術組比較MCAO組腦組織梗死百分比顯著升高；與MCAO組相比，給藥組LBP(100 mg/kg、50 mg/kg)組及尼莫地平組腦梗死范圍明顯減小(P<0.01，P<0.05，P<0.05)，提示LBP對小鼠缺血再灌注腦損傷有保護作用(見圖1)。

2.2LBP對腦缺血再灌注小鼠神經功能缺損的影響缺血再灌24 h后，假手術組小鼠行為正常，無神經功能缺損癥狀。MCAO組小鼠均出現明顯的神經行為缺陷癥狀，給藥組LBP(100 mg/kg、50 mg/kg)及尼莫地平組能明顯減輕小鼠神經癥狀(P<0.05，P<0.05，P<0.05)，提示LBP對缺血再灌注小鼠神經損傷有明顯改善作用(見表1)。

2.3LBP對腦缺血再灌注小鼠腦含水量的影響缺血再灌24 h后，與假手術組比較MCAO組小鼠腦含水量明顯升高(P<0.01)，給藥組LBP(100 mg/kg、50 mg/kg)及尼莫地平組與MCAO組比較腦含水量明顯降低(P<0.05，P<0.05，P<0.05)，提示LBP能夠抑制缺血再灌注損傷引起的腦水腫(見表1)。

2.4LBP對腦缺血再灌注小鼠大腦皮質NOX4蛋白表達的影響小鼠腦缺血再灌注24 h后，與假手術組相比，MCAO組小鼠大腦皮質缺血區NOX4蛋白表達明顯增高。LBP(100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg)劑量組NOX4水平較MCAO組顯著降低(P<0.01)。提示LBP能夠抑制缺血損傷小鼠大腦皮質NOX4表達的增高(見圖2)。

2.5LBP對小鼠缺血側腦組織ROS含量的影響DHE染色結果顯示，小鼠腦缺血再灌注24 h后，與假手術組相比，MCAO組小鼠大腦皮質缺血區ROS含量明顯增高，LBP(100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg)劑量組ROS水平較MCAO組顯著降低(P<0.01)。提示LBP能夠抑制缺血損傷小鼠大腦皮質ROS的生成。(見圖3)。

2.6LBP對小鼠缺血側腦組織勻漿SOD活性的影響與假手術組相比，MCAO組小鼠腦組織勻漿SOD活力明顯降低(P<0.01)，LBP(100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg)劑量組及尼莫地平組與MCAO組相比SOD活力明顯增高(P<0.01，P<0.01，P<0.05，P<0.01)，提示LBP能提高缺血再灌小鼠腦組織SOD活力(見表2)。

2.7LBP對小鼠缺血側腦組織勻漿GSH-Px活力的影響與假手術組相比，MCAO組小鼠腦組織勻漿GSH-Px活力明顯降低(P<0.01)，LBP(100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg)劑量組和尼莫地平組與MCAO組相比GSH-Px活力明顯增高(P<0.01，P<0.01，P<0.05，P<0.01)，提示LBP能提高缺血再灌小鼠腦組織GSH-Px活力(見表2)。

2.8LBP對小鼠缺血側腦組織勻漿MDA含量的影響與假手術組相比，MCAO組小鼠腦組織勻漿MDA含量明顯升高(P<0.01)，LBP(100 mg/kg、50 mg/kg)劑量組及尼莫地平組與MCAO組相比MDA含量明顯降低(P<0.01，P<0.05，P<0.05)，提示LBP能降低缺血再灌小鼠腦組織MDA含量(見表2)。

表1　LBP對腦缺血再灌注小鼠神經功能缺損和腦含水量的影響±s)

*P<0.05，**P<0.01 vs vehicle

表2　LBP對小鼠缺血再灌注后SOD、GSH-PX、MDA的影響

*P<0.05，**P<0.01 vs vehicle

圖1LBP(100 mg/kg、50 mg/kg)組及尼莫地平組腦梗死范圍較模型組減小(P<0.01)

圖2LBP降低小鼠腦缺血再灌注24 h大腦皮質NOX4水平，與假手術組比較##P<0.01，與模型組比較**P<0.01

A：假手術組；B：模型組；C：LBP 100 mg/kg組；D：LBP 50 mg/kg組；E：LBP25 mg/kg組

3　討　論

在缺血性腦血管病的治療中，恢復缺血區的血流或加強對缺血區的血流供應是減輕缺血對中樞神經系統細胞結構和功能損傷的必要條件。但是，大量研究表明，如果腦血流的疏通和恢復超過一定的時間點，不僅不能改善缺血引起的組織損傷和功能障礙，反而會造成神經損傷進一步加重，這種現象即缺血再灌注損傷。抑制再灌注損傷是治療缺血性腦血管病的重要環節[6，7]。本研究采用小鼠短暫性局灶性大腦中動脈阻塞模型觀察LBP對腦缺血再灌注損傷的作用，結果顯示LBP不但能夠改善缺血再灌注損傷小鼠的神經功能障礙，而且能減小腦梗死體積，降低腦水腫的程度，說明LBP干預對小鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

腦缺血后，炎癥、凋亡、氧化應激、興奮性毒性等多種因素相互作用，相互影響，從而加劇神經損傷的發生、發展[8]。近年來的研究表明，氧化應激反應在腦缺血再灌注損傷中起核心作用，腦缺血時，氧化應激及其產生的超氧陰離子、羥自由基等活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)損害是急性腦缺血損傷的重要機制[9，10]。NADPH氧化酶是超氧陰離子專有催化酶，在氧自由基的產生過程中起著重要作用。NADPH氧化酶類有多種形式的亞單位復合體，腦組織中主要的NADPH氧化酶為其亞型NOX2，NOX4，NOX5等。在腦組織中，NOX4在內皮細胞、神經元和膠質細胞中均有表達。研究表明，當局灶性腦缺血發生時，NOX4的表達明顯上升，導致ROS的生成增多[11]。本實驗結果顯示，LBP能夠顯著下調缺血再灌引起的小鼠大腦皮質NOX4表達的增高，從而抑制腦組織中ROS的生成，對小鼠腦缺血再灌注損傷產生保護作用。

腦缺血時產生的大量ROS過度消耗了機體內源性抗氧化酶，導致多種酶的表達和活性發生改變，如SOD、GSH-Px、CAT等。抗氧化酶活性的降低，使腦組織清除ROS的能力下降，過量蓄積的ROS可引起脂肪氧化，蛋白質氧化和DNA損傷，能量代謝衰竭，甚至細胞死亡[12]。MDA是ROS攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化反應的最終產物，其含量的變化間接地反映了氧自由基含量的變化及其對組織的損傷程度。本實驗結果顯示，LBP能明顯抑制缺血再灌損傷小鼠腦組織中ROS的生成，升高SOD活力和GSH-Px活力，減少MDA含量，提示LBP可能通過減少自由基的生成，增強機體清除自由基能力，抑制脂質過氧化反應，而減輕腦組織的損傷。

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Neuroprotection of LBP on a mouse model of transient focal cerebral ischemia and its protective mechanisms of inhibiting oxidative stress

GEJianbin，LUHongjian，SONGXinjian，etal.

(TheSecondPeople’sHospitalofNantong，Nantong226002，China)

ObjectiveTo observe the protective effects of lycium barbarum polysaccharides (LBP) on cerebral ischemia-reperfusion injury in mice and explore its mechanism. MethodsCerebral ischemia-reperfusion injury in mice was induced by middle cerebral artery occlusion. The neurological outcome，infarct size and water contents were evaluated. Western blotting was used to evaluate the protein levels of NOX4.DHE staining was used to evaluate levels of ROS. SOD and GSH-Px activity，MDA levels of ischemia cerebral tissue were determined by spectrophotometry using commercial kits. ResultsLBP markedly improved neurologic deficits，and decreased infarct size and edema at 24 h after reperfusion in mice. Western blot analysis indicated that LBP markedly down-regulated the protein level of NOX4. DHE staining indicated that LBP decreased the levels of ROS in ischemic cortex 24 h after reperfusion. SOD activity and GSH-Px activity in LBP groups was higher，and MDA level in LBP groups were significantly lower than those in vehicle group．ConclusionLBP has protective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury in mice，and this effect may be associated with inhibiting oxidative stress induced by cerebral ischemia-reperfusion.

LBP；Cerebral ischemia；Oxidative stress；NOX4；ROS

1003-2754(2016)09-790-05

2016-03-15；

2016-09-03

國家自然科學基金青年項目(No．31500822)；南通市社會事業科技創新與示范計劃項目(No．HS2013020)

(1.南通市第二人民醫院，江蘇 南通 226002；2.蘇州大學藥理教研室，江蘇 蘇州 215123；3.南通大學藥理教研室，江蘇 南通 226001)

吳鋒，Email：cuileish@163.com

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