綿羊肌肉組織MyoG和PID1 基因的表達及其與肌內脂肪含量的關系

欒兆進，賀建寧，程　明，劉開東，曲緒仙，柳　楠*

(1.青島農業大學動物科技學院，青島 266109；2.包頭市農業科學研究所，包頭 014013；3.青島市畜牧獸醫研究所，青島 266121；4.山東省畜牧總站，濟南 250000)

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綿羊肌肉組織MyoG和PID1 基因的表達及其與肌內脂肪含量的關系

欒兆進1,2，賀建寧1，程明3，劉開東3，曲緒仙4，柳楠1*

(1.青島農業大學動物科技學院，青島 266109；2.包頭市農業科學研究所，包頭 014013；3.青島市畜牧獸醫研究所，青島 266121；4.山東省畜牧總站，濟南 250000)

本研究旨在探究綿羊不同部位肌肉MyoG和PID1基因mRNA的發育變化規律，分析MyoG和PID1 基因mRNA表達水平對肌內脂肪沉積的影響。選取2、4、5、6 月齡敖漢細毛羊公羔和12月齡敖漢細毛羊成年公羊各5只，屠宰后取背最長肌和股二頭肌檢測肌內脂肪(Intramuscular fat，IMF)含量，用實時熒光定量 PCR 檢測兩個部位肌肉MyoG和PID1 mRNA 表達量，并進一步分析表達量與肌內脂肪含量的關系。結果表明，2～5月齡時，背最長肌和股二頭肌的IMF含量均隨著月齡的增加而增加；而5～12月齡時則基本保持不變；同月齡背最長肌IMF 含量極顯著高于股二頭肌(P<0.01)。兩個部位肌肉MyoG和PID1 mRNA 表達的發育模式有所不同，具有組織特異性。背最長肌MyoG基因表達量5月齡最高(P<0.01)，PID1基因表達量6月齡最高(P<0.05)，均呈上升-下降趨勢；股二頭肌MyoG和PID1基因各月齡之間表達量均差異極顯著(P<0.01)，MyoG基因表達量隨著月齡增長呈上升-下降趨勢，PID1基因表達量大體呈下降-上升趨勢。同月齡MyoG和PID1 表達量存在組織差異。相關分析表明，MyoG和PID1 表達量與 IMF 含量呈不同程度正相關。綜上，MyoG基因表達對綿羊肌內脂肪的沉積可能有正調控作用，而PID1基因表達可能對肌內脂肪的沉積產生一定的影響。

肌內脂肪；MyoG；PID1；表達規律；相關性

近年來，肥羔肉因其瘦肉率高、口感鮮嫩、營養價值高、膽固醇含量低等特點使得市場需求量不斷上升[1]，敖漢細毛羊因其適應性強、抓膘快、繁殖率高等優點比較適合肥羔生產，增加肥羔肉產量，以更好的適應市場需求量。肌內脂肪(Intramuscular fat，IMF)的沉積量在一定程度上決定了口感品質[2]，若能在穩定瘦肉比例的基礎上，適量提高IMF含量，可以有效的改善羊肉口感品質，了解脂肪沉積機理及規律可為改善肉質提供理論依據[3]，此領域的研究具有較好的實際意義[4]。研究表明，0～6月齡綿羊肌內脂肪含量呈上升趨勢，12月齡基本維持與6月齡相同的水平[5]。

遺傳和環境因素的改變都會導致IMF沉積產生變化，其中遺傳因素的影響較大。利用分子生物學的標記輔助選擇來研究調控IMF含量的主效基因，通過品種選育來提高IMF含量是改善肉質的可行途徑之一[6]。肌細胞生成素(Myogenin，MyoG)基因調控成肌細胞的分化與融合，是調節骨骼肌發育的重要因子[7]，并參與骨骼肌損傷及修復過程[8]，雞Mrf4和MyoG基因共表達參與了骨骼肌細胞終末分化[9]；杜琛檢測到MyoG基因在成熟脂肪細胞中的表達量顯著高于前體脂肪細胞[10]，M.Bocian等發現豬MyoG基因對胴體脂肪沉積和肌肉增長有重要影響[11]，L.Zhu等研究證實MyoG基因極顯著影響肌內脂肪含量[12]，相關研究表明MyoG啟動子區的DNA甲基化變化對脂肪沉積具有一定的調控作用[13]。磷酸酪氨酸互作結構域1(Phosphotyrosine interaction domain containing1，PID1)基因通過引起線粒體功能障礙而導致與肥胖相關的胰島素抵抗使葡萄糖攝取降低，同時影響成熟脂肪細胞線粒體中的脂肪酸合成酶合成乙酰基來調控脂肪酸的合成，進而對脂肪沉積產生促進作用[14-16]。PID1基因在山羊內臟和肌肉組織中均有不同程度表達，其中背最長肌的表達量在不同月齡間表現出發育特異性[17]。相關研究表明，PID1可能影響山羊和豬肌肉組織中IMF沉積[18-19]。綿羊MyoG和PID1基因的表達對IMF沉積是否產生影響鮮有報道。

本研究擬通過實時熒光定量PCR對綿羊不同肌肉組織MyoG和PID1基因的表達規律進行研究，并分析其與IMF含量的關系，為尋找綿羊肉質相關候選基因提供依據。

1　材料與方法

1.1試驗動物

試驗羊來自青島奧特種羊場，飼養管理條件一致，分別選擇2、4、5、6、12月齡的毛肉兼用型敖漢細毛羊各5只，現場屠宰，迅速采集背最長肌、股二頭肌組織樣，并立即置于液氮中，然后保存于-80 ℃冰箱，用于總RNA提取。另取背最長肌、股二頭肌樣各150 g，于-20 ℃保存，待測IMF含量。

1.2主要試劑

Tripure RNA Isolation Reagent，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，LightCycler?480 SYBR Green I Master購于Roche公司；瓊脂糖購于 Thermo scientific 公司；Dream Taq Green PCR Master Mix(2×) 購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1總RNA提取和cDNA第一鏈的合成取50 mg各組織樣加液氮充分研磨，采用Trizol法提取背最長肌、股二頭肌組織的總RNA，采用Eppendorf BioPhotometer Plus 分光光度計測量RNA濃度，并通過電泳檢測其完整性。反轉錄總RNA用量為1 μg，按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒上的操作進行，合成的cDNA于-20 ℃貯存。

1.3.2引物設計參考GenBank綿羊MyoG和PID1基因序列(登錄號：GU550517和XM_012147826)，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參基因，采用Primer5.0設計特異性引物，由生工生物(上海)有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1MyoG、PID1和GAPDH基因引物序列

Table 1MyoG，PID1 andGAPDHgenes primer sequence

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence產物大小/bpProductsize退火溫度/℃AnnealingtemperatureMyoGF:CGTGGGCGTGTAAGGTGTR:GGCGCTCTATGTACTGGATG19560PID1F:CATCTTCGCCTGGGTTTAR:GCCATCGCTCTTCATACTG16558GAPDHF:GTCGGAGTGAACGGATTTR:CTCTGCCTTAGCATCAGCC17460

1.3.3MyoG和PID1基因在綿羊肌肉組織的表達量測定采用羅氏LightCycler?480實時熒光定量PCR儀進行定量分析。每個待測樣本設3個重復，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算分析數據。采用20 μL實時熒光定量PCR反應體系，包含10 μL SYBR@Premix EX Taq TMⅡ(2×)、0.5 μL PCR Forward primer(10 μmol·L-1)、0.5 μL PCR Reverse primer(10 μmol·L-1)、1.0 μL DNA Templet(<100 ng)、8.0 μL dd H2O(滅菌蒸餾水)。

1.3.4IMF含量測定采用索氏抽提法測定背最長肌、股二頭肌中的IMF含量，每個樣品重復測量3次，按照公式：IMF含量(%)=(x-y)/a×100%計算IMF含量，式中x表示浸提前含烘干樣品濾紙包重，y表示浸提后含烘干樣品濾紙包重，a表示烘干樣品重。

1.3.5數據分析熒光定量的數據采用2-ΔΔCt法進行相對表達處理，構建單因素試驗線性模型：

式中：yij表示mRNA的表達量，μ表示總體平均數，αi表示組織效應，εij表示試驗誤差。使用統計學軟件SPSS17.0對試驗結果進行單因素方差分析，采用Duncan法對各年齡間mRNA表達量和IMF含量的主效應進行多重比較，采用獨立樣本T檢驗分別對同月齡兩塊肌肉基因表達量和肌內脂肪含量進行比較，采用Pearson分析方法對MyoG和PID1基因 mRNA表達量與IMF含量進行相關分析。

2　結　果

2.1總RNA提取與檢測

提取組織總RNA后，經Eppendorf BioPhotometer Plus 分光光度計檢測，D260 nm/OD280 nm為1.8～2.0，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由圖1可見，28SRNA和18SRNA均較明亮，且兩條帶的比值接近2∶1，表明所提取的總RNA完整性較好，濃度和純度可以滿足后續試驗要求。

M.DNA相對分子質量標準；1～2.總RNAM.DL-2000 bp marker；1-2.Total RNA圖1　總RNA電泳圖Fig.1　The electrophoresis of total RNA

2.2MyoG和PID1基因普通PCR擴增結果

由圖2可見，內參基因GAPDH、目的基因MyoG和PID1的PCR電泳結果顯示，引物擴增目的條帶單一，大小與設計的一致，說明引物可用。

M.DNA相對分子質量標準M.DL-1000 bp marker圖2　綿羊GAPDH(a)、MyoG(b)和PID1基因(c)擴增產物Fig.2　PCR products of sheep GAPDH (a)，MyoG (b) and PID1(c) genes

2.3綿羊不同肌肉部位 IMF 含量的發育性變化

對5個時期綿羊肌肉IMF含量進行測定，結果見表2，2、4、5、6月齡敖漢細毛羊羔羊的背最長肌IMF含量逐漸增加，5、6、12月齡IMF含量極顯著高于2和4月齡(P<0.01)；其中2與4月齡差異不顯著，5、6、12月齡間差異不顯著(P>0.05)。股二頭肌IMF含量呈緩慢的上升趨勢，5月齡極顯著高于2和4月齡(P<0.01)，6和12月齡顯著高于2和4月齡(P<0.05)；其中2和4月齡差異不顯著(P>0.05)，5月齡與6和12月齡差異顯著(P<0.05)，6和12月齡差異不顯著(P>0.05)。從同月齡不同肌肉部位IMF含量來看，背最長肌IMF含量極顯著高于股二頭肌(P<0.01)。

表2綿羊背最長肌和股二頭肌IMF含量

Table 2IMF content oflongissimusdorsiandbicepsfemorisin sheep (Mean±SD)

月齡Monthsofage背最長肌IMF含量/%LongissimusdorsiIMFcontent股二頭肌IMF含量/%BicepsfemorisIMFcontent23.067±0.404Aa1.733±0.153Bb44.467±0.503Aa3.300±0.608Bb59.160±0.985Aa**8.650±0.208Bb**69.167±1.258Aa**7.200±0.624Bb*129.163±0.777Aa**6.967±0.764Bb*

同一月齡不同部位間的差異用字母表示：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。**.表示同部位不同月齡間差異極顯著(P<0.01)；*.表示同部位不同月齡間差異顯著(P<0.05)

In different parts of muscles at the same age，different lowercase letters means significant difference between muscles (P<0.05)，different capital letters means extremely significant differences between muscles(P<0.01).**. Indicates extremely significant differences (P<0.01) between different ages of the same part of muscles;*. Indicates significant differences (P<0.05) between different ages of the same part of muscles

2.4綿羊肌肉組織MyoG基因mRNA 表達量的發育性變化

如圖3所示，內參和MyoG基因引物擴增特異性較好，可用于下一步試驗。采用qRT-PCR法對2、4、5、6月齡綿羊羔羊和12月齡育成羊的背最長肌、股二頭肌兩個部位肌肉的MyoG基因mRNA表達量進行分析，結果顯示(圖4)，綿羊兩個部位肌肉MyoG基因表達的發育性變化規律有差異，背最長肌該基因的表達量先上升后下降，從2月齡開始逐漸增加，5月齡時最高，且極顯著高于4月齡(P<0.01)，而與6月齡差異不顯著(P>0.05)，12月齡有所下降，且與6月齡差異極顯著(P<0.01)；股二頭肌該基因的表達量先上升后下降，各月齡之間表達量均差異極顯著(P<0.01)。將同月齡不同部位肌肉MyoG基因mRNA表達量進行比較發現，4月齡背最長肌顯著高于股二頭肌(P<0.05)，其余月齡背最長肌極顯著高于股二頭肌(P<0.01)。

圖3　GAPDH(A)、PID1(B)和MyoG(C)基因熔解曲線Fig.3　Dissociation curves of GAPDH(A)， PID1(B) and MyoG(C) genes

bj.背最長肌；gj.股二頭肌。同部位不同月齡間的差異用字母表示，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。**.表示同月齡不同部位間差異極顯著(P<0.01)；*.表示同月齡不同部位間差異顯著(P<0.05)。圖5同bj. Longissimus dorsi；gj.Biceps femoris. In the same part of muscles，common letter indicate no difference between ages (P>0.05)，different lowercase letters means significant difference between ages (P<0.05)，different capital letters means extremely significant difference between ages(P<0.01).**. Indicates extremely significant differences (P<0.01) between different parts of muscle at the same age；*. Indicates significant differences (P<0.05) between muscles at the same age.The same as Figure 5圖4　MyoG基因組織表達量的發育性變化Fig.4　The developmental changes of the expression level of MyoG in tissues

2.5綿羊肌肉組織PID1基因 mRNA 表達量的發育性變化

如圖3所示，內參和PID1基因引物擴增特異性較好，可用于下一步試驗。采用qRT-PCR法對2、4、5、6月綿羊羔羊和12月齡育成羊的背最長肌、股二頭肌兩個部位肌肉的PID1 mRNA表達量進行分析，結果顯示(圖5)，綿羊背最長肌該基因的表達量先上升后下降，2、4、5月齡間均差異極顯著(P<0.01)，6月齡與5和12月齡差異顯著(P<0.05)；股二頭肌該基因的表達量先下降后上升，各月齡之間表達量均差異極顯著(P<0.01)。將同月齡不同部位肌肉PID1 mRNA表達量進行比較發現：2月齡背最長肌與股二頭肌差異不顯著(P>0.05)，4、5、6、12月齡背最長肌極顯著高于股二頭肌(P<0.01)。

圖5　PID1基因組織表達量的發育性變化Fig.5　The developmental changes of the expression level of PID1 in tissues

2.6綿羊肌肉組織MyoG和PID1基因 mRNA表達水平與肌內脂肪含量的相關性

對綿羊兩個部位肌肉MyoG和PID1的表達量與IMF含量的相關分析(表3)表明，5個時期的背最長肌MyoG的表達量與IMF含量呈顯著正相關(P<0.05)，相關系數為0.896；5個時期的股二頭肌MyoG的表達量與IMF含量呈顯著正相關(P<0.05)，相關系數為0.953；5個時期的背最長肌PID1的表達量與IMF含量呈極顯著正相關(P<0.01)，相關系數為0.996，5個時期的股二頭肌PID1的表達量與IMG含量呈不顯著正相關，相關系數為0.548。如圖6所示，可以直觀的看出背最長肌和股二頭肌MyoG和背最長肌PID1基因的表達量與各自IMF含量趨勢呈不同程度一致性，而股二頭肌PID1基因的表達量與其IMF含量趨勢的一致性不明顯，這與相關分析數據的結果一致，也說明了數據的準確性。

表3MyoG和PID1 mRNA表達量與IMF含量的相關性

Table 3Correlation analysis ofMyoGandPID1 mRNA and IMF content

指標IndexMyoG基因mRNA表達量MyoGmRNAexpressionlevelPID1基因mRNA表達量PID1mRNAexpressionlevel背最長肌IMF含量LongissimusdorsiIMFcontent0.896*0.996**股二頭肌IMF含量BicepsfemorisIMFcontent0.953*0.548

*.顯著相關(P<0.05)；**.極顯著相關(P<0.01)

*.Indicates significant correlation (P<0.05)；**.Indicates extremely significant correlation (P<0.01)

A.背最長肌MyoG與IMF；B.股二頭肌MyoG與IMF；C.背最長肌PID1與IMF；D.股二頭肌PID1與IMFA.Longissimus dorsi MyoG and IMF；B.Biceps femoris MyoG and IMF；C.Longissimus dorsi PID1 and IMF；D.Biceps femoris PID1 and IMF圖6　背最長肌和股二頭肌MyoG、PID1表達量與IMF含量趨勢Fig.6　Longissimus dorsi and biceps femoris MyoG，PID1 expression and IMF content tendency

3　討　論

MyoG是至關重要的成肌調節因子[7]，其表達水平對肌細胞的生成、融合以及肌肉組織生長都會產生重要影響。M.Bocian等發現豬MyoG對胴體脂肪沉積和肌肉增長有重要影響[11]。L.Zhu等研究證實MyoG基因的表達對IMF含量產生極顯著影響[12]。張曉卉研究顯示MyoG只在骨骼肌組織中有所表達，而在內臟、消化器官、卵巢中均不表達[20]，所以只選取肌肉組織作為MyoG基因表達的研究對象。相關遺傳學、藥理學和生理學試驗結果都曾表明，PID1直接調節細胞生長和成脂過程，對脂肪細胞分化不產生影響[15，21]。PID1對多個組織胰島素的敏感性有調節作用，可能與胰島素PI3K和Ras-MAPK信號途徑有關[22]，通過影響脂肪細胞胰島素敏感性的高低調控脂肪沉積[23]。PID1基因在肥胖者脂肪組織中的表達量顯著高于健康者的脂肪組織，由此推斷PID1是調節脂肪細胞成脂過程的相關基因[24]。

結合綿羊與山羊和豬的種間保守性[25]，MyoG和PID1可能同樣調控綿羊的脂質代謝。而肌肉組織是IMF沉積最主要的組織[26]，由此選取了背最長肌和股二頭肌兩塊典型的肌肉組織來研究MyoG和PID1對IMF沉積的影響。mRNA水平的表達分析是研究不同組織中分子調控機制要充分考慮的一個方面[27]，為基因功能的驗證提供選擇依據。

本試驗通過熒光定量PCR發現，2、4、5、6、12月齡綿羊兩個部位肌肉MyoG和PID1 基因mRNA 表達的規律不同，背最長肌MyoG和PID1表達量呈上升-下降趨勢；股二頭肌MyoG表達量呈先上升后下降趨勢，PID1基因呈下降-上升趨勢。2、5、6、12月齡綿羊MyoG基因和4、5、6、12月齡綿羊PID1基因在背最長肌和股二頭肌之間表達量存在極顯著差異，表明MyoG和PID1的轉錄具有一定的組織特異性。IMF測定的結果顯示，各月齡背最長肌和股二頭肌的IMF含量差異極顯著，并且這兩個部位的MyoG基因表達量與各自的IMF含量均表現出顯著正相關，而PID1基因表達量與各自的IMF含量分別表現出極顯著和不顯著正相關，初步表明MyoG和PID1基因表達對IMF沉積可能具有一定的積極作用，此結論與前人在其他物種上的研究基本相符，這兩個基因對綿羊IMF同樣有一定的調控作用。

MyoG和PID1對于綿羊IMF的影響和調控機制仍處在基礎研究階段，未來可以考慮通過細胞水平RNA干擾和超表達來驗證其表達對綿羊細胞脂肪沉積的影響，找到其調控通路、互作基因以及調節因子，以準確判斷MyoG和PID1是否為影響綿羊育肥性狀的候選基因。

4　結　論

本研究發現MyoG和PID1在不同時期綿羊的背最長肌、股二頭肌組織中均有表達，且MyoGmRNA表達量與各自的IMF含量均表現出顯著正相關，PID1 mRNA表達量與各自的IMF含量分別表現出極顯著和不顯著正相關，結果可為進一步研究MyoG和PID1的功能和脂質代謝調控通路提供基礎數據。

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(編輯郭云雁)

Association of theMyoGandPID1 Gene Expression with Intramuscular Fat Content in Sheep Muscles

LUAN Zhao-jin1，2，HE Jian-ning1，CHENG Ming3，LIU Kai-dong3，QU Xu-xian4，LIU Nan1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China；2.BaotouAgriculturalResearchInstitute,Baotou014013,China;3.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicineofQingdao，Qingdao266121，China；4.StationoftheShandongAnimalHusbandryandVeterinary，Jinan250000，China)

The objectives of this study were to investigate the developmental changes of Myogenin (MyoG) and Phosphotyrosine interaction domain containing 1 (PID1) mRNA expression in different parts of muscles in sheep and research its effect on intramuscular fat (IMF) accumulation.Five Aohan fine wool sheep were slaughtered at 2，4，5，6，12 months，respectively，to collect samples fromlongissimusdorsiandbicepsfemoris，for determining the IMF content.The mRNA expression of theMyoGandPID1 in 2 parts of muscles was investigated by real-time PCR，and association between their mRNA levels and IMF contents were also analyzed.The results showed that，2-5 month，with growing of the age，the IMF contents oflongissimusdorsiandbicepsfemorisincreased.And 5-12 month，the IMF contents remained unchanged.The IMF content oflongissimusdorsiwere extremely significantly higher thanbicepsfemoris(P<0.01) at the same age.MyoGandPID1 mRNA expression level was different in 2 parts of muscles and had tissues-dependent.Inlongissimusdorsi，MyoGexpression level was the highest (P<0.01) in 5 month old sheep，PID1 expression level was the highest (P<0.05) in 6 month old sheep，there was an increase and then decrease trend in the 2 gene expression.Inbicepsfemoris，theMyoGandPID1 expression level difference was extremely significant(P<0.01) among different month ages，andMyoGexpression level presented increased and declined slowly with growing，PID1 expression level presented declined-increased with growing.In the same month，MyoGandPID1 expression level had significant difference in different parts.Correlation analysis showed thatMyoGandPID1 expression level was inordinately positively related to IMF content.In conclusion，MyoGexpression has positively effect on IMF accumulation in sheep，andPID1 expression is likely to influence on IMF accumulation.

IMF；MyoG；PID1；expression changes；correlation

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.006

2016-02-03

山東省良種工程項目(2011-16)

欒兆進(1991-)，女，山東青島人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail:15264246691@163.com

柳楠，教授，博士，E-mail:nanliu@sina.com

S826;S813.3

A

0366-6964(2016)10-1986-09