長裂苦苣菜萃取物對胰島素抵抗 HepG2細胞糖代謝的影響*

楊艷華，林素靜，劉西京，杜 斌

（1.鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450001；2.深圳職業技術學院 應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055）

長裂苦苣菜萃取物對胰島素抵抗 HepG2
細胞糖代謝的影響*

楊艷華1，2，林素靜2*，劉西京2，杜 斌1

（1.鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450001；2.深圳職業技術學院 應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055）

使用高濃度胰島素來誘導HepG2細胞，使之出現葡萄糖代謝的異常，以此建造胰島素抵抗HepG2/IR細胞模型，利用葡萄糖測定試劑盒檢測長裂苦苣菜石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位組葡萄糖消耗量，研究長裂苦苣菜不同萃取部位對胰島素抵抗HepG2細胞模型糖代謝的影響.結果顯示，10-6mol/L濃度的胰島素誘導處理HepG2細胞24 h是產生胰島素抵抗的最佳條件；與HepG2/IR模型組相比，各萃取部位均可以改善HepG2/IR細胞的葡萄糖消耗情況，以乙酸乙酯部位效果最佳.結果表明長裂苦苣菜提取物有一定的改善胰島素抵抗的作用.

長裂苦苣菜；胰島素抵抗；HepG2細胞；葡萄糖消耗量

糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者中超過90%為Ⅱ型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus， T2DM），其顯著的病理生理學特征為胰島素調節與控制葡萄糖代謝能力的下降，即胰島素抵抗（Insulin Resistance, IR）[1].HepG2 細胞存在于動物肝細胞，其肝胚胎瘤細胞株的表型與肝細胞很相似，HepG2 細胞中的胰島素受體數目在高劑量的胰島素條件下呈下降趨勢，且下降程度與刺激持續時間及胰島素劑量呈正相關.因此，以HepG2細胞模型來研究體外胰島素抵抗機制和降糖活性物質篩選是理想d的選擇[2-3].

長裂苦苣菜（ Sonchus brachyotus DC.）又名苦菜、苦曲菜、苦曲曲、苦苣菜、苣荬菜、苦荬菜等，具有清熱解毒、涼血止血之功，常用于治療急性咽炎、急性痢疾、闌尾炎、腸炎、痔瘡腫痛等[4-6].研究表明，長裂苦苣菜具有降糖、抗菌、降壓和降膽固醇、抗心律失常、抗腫瘤、保肝、抗炎、清除自由基等作用[4-8].本文以人肝癌細胞HepG2建立胰島素抵抗模型，探究長裂苦苣菜不同萃取部位對胰島素抵抗 HepG2 細胞糖代謝的影響.

1 材 料

1.1 藥品與試劑

長裂苦苣菜（ Sonchus brachyotus DC.）采自蘭州郊區； DMEM高糖培養基（Corning公司）；胰酶、四氮甲唑藍（MTT）、胎牛血清（Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO）、乙醇（分析純）、鹽酸二甲雙胍（上海源葉生物科技有限公司，批號：S16O5G1）；精蛋白生物合成人胰島素注射液（規格400IU/10mL/支，諾和諾德中國制藥有限公司，批號：EVG2553）；葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物藥業有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS），D-Hank’s溶液.

1.2 儀器

DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋（鄭州南北儀器設備有限公司）；Milli-Q超純水機（Milipore）；4001 型旋轉蒸發儀（德國Heidolph）；HERA cell 240 型CO2 細胞培養箱（Thermo）；DM IRB 型熒光倒置顯微鏡（德國Leica ）；BHC-ⅡA2系列生物安全柜（蘇凈安泰空氣技術有限公司）； 電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；SS-325高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械有限公司）；Multiskan MK3 全自動酶標儀（Thermo）；BS224s電子天平（德國賽多利斯）；可調式移液器（Eppendorf）；細胞培養瓶（25cm2）、96孔細胞培養板（美國Corning公司）.

1.3 細胞系及細胞培養

人肝癌細胞株HepG2，由深圳市大規模細胞培養技術和細胞資源庫技術平臺王妍教授饋贈.將HepG2細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，溫度設定37℃，培養基放置在5% CO2培養箱中.傳代間隔為2～3天1次，取對數生長期細胞進行實驗.

2 方 法

2.1 樣品制備與溶液配制

2.1.1 樣品制備

取長裂苦苣菜全草粉碎，過10目篩(2.0 mm)，稱取60g，70%乙醇回流提取3次，每次1h，合并濾液，減壓回收溶劑，所得浸膏加蒸餾水溶解混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，隨后減壓回收各有機溶劑，并于60℃烘干，即得不同提取部位，得率分別是0.45%、1.12%和3.25%.精密稱量，用完全培養液分別配成0.001、0.01、0.1、0.25 mg/mL備用.

2.1.2 配制完全培養液

取胎牛血清和DMEM高糖培養液按照1: 9比例配置完全培養液.

2.2 胰島素濃度對胰島素抵抗細胞模型的影響考察

使用完全培養基將對數生長期HepG2細胞進行稀釋，設定細胞濃度為1×105個/mL，將其接種在96孔細胞培養板中培養，單孔200 μL，于37 ℃、5% CO2培養箱中.當細胞貼壁達瓶底80%時，棄上清液，以D-Hank’s液清洗2次，加入新鮮調配的含10-6，10-7，10-8，10-9mol/L胰島素的完全培養液繼續培養細胞，每孔200 μL，一組3個復孔，并設正常培養細胞的平行對照組.培養時間24h，取各組的細胞上清液，以葡萄糖氧化酶法依次測定各組的葡萄糖含量，同時觀察記錄細胞在顯微鏡下的形態學變化.

2.3 胰島素抵抗細胞模型時間影響考察

取對數生長期HepG2細胞，同2.2項下方法培養細胞，加入10-6mol/L的胰島素后，各組于37 ℃、5% CO2條件下培養8、12、24、36和48 h，取各組的細胞上清液，用葡萄糖氧化酶法依次測定每組的葡萄糖含量，同時觀察記錄細胞在顯微鏡下的形態學變化.

通過上述試驗選取最優的胰島素作用時間和胰島素濃度，建立適宜的HepG2 胰島素抵抗細胞模型.

2.4 不同濃度各萃取物對HepG2細胞胰島素抵抗模型葡萄糖消耗的影響

根據上述考察參數建立HepG2細胞胰島素抵抗模型，設置二甲雙胍濃度梯度組、胰島素抵抗模型組、正常對照組和萃取部位石油醚、乙酸乙酯、正丁醇濃度梯度組，其中空白組不接種細胞，每組設置5個復孔.正常對照組每孔各加完全培養液200μL，胰島素抵抗模型組加10-6mol/L胰島素的完全培養液200 μL/孔，其余給藥組每孔分別加入不同濃度溶液200 μL，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養.24h后取各組上清培養液，以葡萄糖氧化酶法測定其葡萄糖含量.隨后移出上清培養液，每孔加入180 μL完全培養液和20 μL 0.5% MTT，培養4h，將培養液吸棄，每孔加入150 μL DMSO，震搖10 min，于490 nm處用酶標儀測OD值.

2.5 計算

葡萄糖消耗量（mmol/L）=對照組葡萄糖含量-給藥組葡萄糖含量.

2.6 統計分析

3 結 果

3.1 不同濃度胰島素對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

實驗結果見表1，可見隨著胰島素濃度的增大，葡萄糖消耗率越來越大，但當濃度達到10-6mol/L時，葡萄糖消耗率突然下降，幾乎與正常對照組一致，說明在較低濃度范圍時，胰島素對葡萄糖的消耗具有一定的促進作用，當達到一定量時，導致了胰島素抵抗，細胞對葡萄糖的消耗急劇降低.當胰島素濃度在10-6mol/L時，胰島素誘導HepG2細胞胰島素抵抗程度達到最大.倒置顯微鏡下觀察，正常組HepG2細胞為菱形或梭形的貼壁細胞，與典型的腫瘤細胞形態學特征相似，10-6mol/L濃度模型組細胞邊緣變成稍圓形，說明高濃度胰島素對HepG2的活性有一定的抑制作用.

3.2 胰島素作用不同時間對 HepG2 細胞葡萄糖消耗量的影響

加入10-6mol/L的胰島素完全培養液，分別作用8、12、24、36、48h，測得細胞葡萄糖消耗情況見表2.根據結果可知，在最初達到12h時，胰島素對HepG2的葡萄糖消耗率達到了最大，為41.58%，隨著作用時間的延長，葡萄糖消耗率逐漸降低，在24、36、48h分別為20.29%、17.33%、8.98%，說明在24h小時已開始出現胰島素抵抗，故本實驗建立胰島素抵抗模型中最佳胰島素濃度為10-6mol/L，最佳作用時間為24h.

3.3 不同萃取部位對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗的影響及MTT檢測結果

由結果可知，正常組（p<0.05）單位細胞葡萄糖消耗量明顯高于模型組，說明胰島素抵抗HepG2細胞模型建立成功.另一方面，MTT檢測的OD值卻顯著降低（p<0.05），說明高濃度的胰島素對細胞產生了一定的毒性，這也可能是導致模型組葡萄糖消耗量下降的原因之一.與HepG2/IR 模型組相比較，二甲雙胍不同濃度作用于模型細胞后，模型細胞的葡萄糖消耗量均有不同程度增加，其中葡萄糖消耗量最多的是0.25和0.1 mg/ml濃度組，但由于模型組的OD值（p<0.05）明顯高于0.25 mg/ml濃度組的OD值，說明此濃度下二甲雙胍的細胞毒性較強，這也可能是二甲雙胍在高濃度時對葡萄糖的消耗量反而降低的緣故.

不同濃度石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位作用于模型細胞后，均不同程度地改善了模型細胞的胰島素消耗量.尤以較高的濃度組0.1、0.25mg/ml對葡萄糖的消耗具有較顯著的作用（分別為p < 0.01和 p < 0.05）.

3組隨著濃度的增加，OD值也隨之增加，表明3個不同萃取部位對HepG2細胞的增殖有一定的促進作用，抵消了胰島素對細胞的毒性作用，同時三組的對葡萄糖的消耗也隨之增加，這也可能是長裂苣荬菜改善胰島素抵抗的機制之一.從整體葡萄糖消耗量分析可見，模型細胞的葡萄糖消耗量在乙酸乙酯部位作用后增加最明顯，說明乙酸乙酯部位改善胰島素抵抗效果最佳.結果見表3.

表1 不同濃度胰島素對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響（±S ，n=5）

表1 不同濃度胰島素對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響（±S ，n=5）

胰島素濃度/（mol·L-1）葡萄糖含量/（mmol·L-1）葡萄糖消耗率/（%）0 6.407±0.267 -10-95.770±0.256 9.94 10-85.513±0.286 13.95 10-75.566±0.270 13.12 10-66.589±0.247 -

表2 胰島素作用不同時間對 HepG2 細胞葡萄糖消耗量的影響（±S，n=5）

表2 胰島素作用不同時間對 HepG2 細胞葡萄糖消耗量的影響（±S，n=5）

時間/h正常組葡萄糖含量/（mmol·L-1）胰島素組葡萄糖含量/（mmol·L-1）葡萄糖消耗率/（%）8 3.534±0.0778 2.748±0.0769 22.24 12 2.109±0.386 1.232±0.463 41.58 24 7.224±0.207 5.758±0.214 20.29 36 9.450±0.178 7.812±0.464 17.33 48 10.340±0.371 9.411±0.447 8.98

表3 不同萃取部位對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗的影響及MTT檢測結果（±S，n=5）

表3 不同萃取部位對胰島素抵抗HepG2細胞葡萄糖消耗的影響及MTT檢測結果（±S，n=5）

注：與正常組對比：#p < 0.05，##p < 0.01；與模型對照組對比：* p < 0.05，** p < 0.01

組別 葡萄糖消耗量/（mmol·L-1） OD值正常對照組 3.833±0.077 0.586±0.063 HepG2/IR 模型組 3.079±0.052#0.501±0.030#0.25 3.842±0.144** 0.459±0.026*二甲雙胍組（mg/mL）0.10 4.310±0.085** 0.608±0.063** 0.01 3.596±0.264* 0.594±0.072* 0.001 3.436±0.184* 0.570±0.109 0.25 3.496±0.225* 0.598±0.074*石油醚部位（mg/mL）0.10 3.783±0.074** 0.636±0.095* 0.01 3.256±0.136 0.424±0.086* 0.001 3.131±0.036 0.308±0.091* 0.25 4.254±0.078 ** 0.692±0.061 **乙酸乙酯（ mg/mL）0.10 3.953±0. 055** 0. 587±0.067* 0.01 3.367±0.137* 0.454±0.023* 0.001 3.498±0.197* 0.346±0.076* 0.25 3.996±0.043** 0.643±0.038**正丁醇部位（mg/mL）0.10 3.461±0.180* 0.593±0.065* 0.01 3.348±0.132* 0.466±0.014* 0.001 3.197±0.089* 0.423±0.047*

4 討 論

胰島素抵抗參與了Ⅱ型糖尿病的發生和發展的全過程，是T2DM的重要機制之一[9].因此，從胰島素抵抗的防治著手尋找抗糖尿病的新藥是一個重要的方向.肝臟及周圍組織是胰島素作用的靶器官，HepG2 細胞在高濃度胰島素作用下，HepG2 細胞表面胰島素受體數目下降程度與胰島素水平及刺激持續時間呈正相關[2-3].實驗結果表明，以10-6mol/L的胰島素誘導的模型效果較佳，在培養24h后細胞對胰島素的攝取顯著降低，說明了模型的成功.

實驗表明，各萃取部位對模型細胞的胰島素抵抗敏感度各異，模型細胞的葡萄糖消耗量在乙酸乙酯部位作用后增加最明顯，表明乙酸乙酯部位改善胰島素抵抗效果最佳.從實驗數據可推測：有效范圍內的高濃度萃取物對胰島素抵抗模型細胞的增殖起到促進作用，保護和增強細胞的生命狀態免受損傷，以此促進胰島素抵抗HepG2細胞的葡萄糖消耗；而低濃度的萃取物則是增強細胞對胰島素的敏感性，來改善胰島素抵抗狀況，但這有待于進一步的實驗證明.

根據試驗情況，石油醚萃取部位主要含大量的葉綠素、脂肪烴和少量萜等極性較小的化合物；乙酸乙酯主要含倍半萜類、三萜類、黃酮類等化合物；正丁醇部位主要是苷類化合物，其中活性以乙酸乙酯和正丁醇部位相對較好.從各萃取部位的收率上來說，石油醚部位也遠遠低于其它2個部位，不是長裂苦苣菜的主要活性部位.可見，長裂苦苣菜萃取部位中改善胰島素抵抗效果最佳的是乙酸乙酯部位，為長裂苦苣菜在抗糖尿病領域中的應用研究提供了一定的實驗依據.

[1] 陸菊明.中國2型糖尿病防治指南（2013年版）更新要點的解讀[J].中國糖尿病雜志，2014，22（10）：2-42.

[2] Ma J Z, Yang L X, Shen X L, et al. Effects of Traditional Chinese Medicinal Plants on Anti-insulin Resistance Bioactivity of DXMS-Induced Insulin Resistant HepG2 Cells[J]. Nat Prod Bioprospect, 2014，4（4）：197-206.

[3] 俞發榮，連秀珍，謝明仁，等.胰島素抵抗細胞與大鼠模型的建立及其應用[J].中國實驗動物學報，2013（06）：74-78.

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[9] Samuel V T, Shulman G I. Mechanisms for insulin resistance: common threads and missing link[J]. Cell, 2012，148（5）：852-871.

電子與通信學院學子勇奪“華為網院杯”

2015全國大學生ICT技能大賽桂冠

2015年12月6日“華為網院杯”2015全國大學生ICT技能大賽決賽在深圳圓滿閉幕，我校電信學院學生吳惠民與林曉東勇奪桂冠，王隆杰老師獲得優秀指導教師獎。本次大賽由華為技術有限公司舉辦，來自全國29個省市400多所院校、近5000名在校大學生參加。本次大賽取得的成績不僅表現了我院學生良好的技能水平和職業素養，更體現出我院貫徹“三育人”教育理念取得了實際成果。

（深職院 電子與通信工程學院）

Effect of Bioactive Components from Sonchus Brachyotus D C. on Glucose Metabolism in Insulin Resistant HepG2 Cells

YANG Yanhua1,2, LlN Sujing2*, LlU Xijing2, DU Bin1

（1.College of Pharmacy, Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan 450001, China;
2. School of Applied Chemistry & Biotechnology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen, Guangdong 518055, China）

The purpose of the present paper is to study the different extraction parts from Sonchus brachyotus D C. on glucose metabolism in insulin resistant HepG2 cells. The model of insulin resistance in HepG2 cells induced high concentrations of insulin. Glucose consumption is tested on petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol extraction. Concentration of 10-6mol/L insulin is found to be the best condition for HepG2 cells 24 h to generate insulin resistance. Compared with model group Hepg2/IR, the Sonchus brachyotus D C.’s extraction parts can reduce the HepG2 / IR glucose consumption. It works especially well on the ethyl acetate extract. The results show that Sonchus brachyotus D C.’s extraction parts can improve the effect of insulin resistance.

Sonchus brachyotus D C.; insulin resistance; HepG2 cell; glucose consumption

R285

A

1672-0318（2016）01-0045-05

10.13899/j.cnki.szptxb.2016.01.010

2015-06-18

*項目來源：深圳市大規模細胞培養技術與細胞資源庫公共技術服務平臺（合同號：GGJS20130331152344401）、深圳市科創委2015年基礎研究（JCYJ2015 0630 1141 40632）、深圳職業技術學院青年創新基金（2011年）資助項目

楊艷華（1988-），女，河南人，在讀碩士，研究方向：天然藥用植物的提取分離與純化.

*通訊作者：林素靜（1977-），女，海南人，碩士，副教授，主要研究方向：中藥質量控制研究、藥物制劑.