丹參酮ⅡA對壓力超負荷大鼠心肌血紅素加氧酶-1 mRNA基因表達的作用※

蔡 輝 朱凱媛 趙凌杰 趙智明 董曉蕾 張蓓蓓

(中國人民解放軍南京軍區南京總醫院中西醫結合科，江蘇 南京 210002)

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丹參酮ⅡA對壓力超負荷大鼠心肌血紅素加氧酶-1 mRNA基因表達的作用※

蔡 輝 朱凱媛 趙凌杰 趙智明 董曉蕾 張蓓蓓

(中國人民解放軍南京軍區南京總醫院中西醫結合科，江蘇 南京 210002)

目的 觀察丹參酮ⅡA(TanⅡA)對壓力超負荷大鼠心肌血紅素加氧酶-1(HO-1)mRNA基因表達的影響，并探討其對心肌纖維化、心室重構的保護作用。方法 40只SD大鼠隨機抽取8只為假手術組，其余32只大鼠為手術組采用腹主動脈縮窄術制備壓力超負荷模型，術后手術組存活的22只大鼠再隨機分成3組，分別為模型組(n=7)、TanⅡA組(n=7)及TanⅡA+HO-1抑制劑處理組[TanⅡA+鋅原卟啉(ZnPP)注射液組，n=8)。造模術后第4周開始給藥，假手術組、模型組均以0.9%氯化鈉注射液4 mL/(kg·d)腹腔注射；TanIIA組以丹參酮ⅡA磺酸鈉(STS)注射液20 mg/(kg·d)腹腔注射；TanIIA+ZnPP組以STS注射液20 mg/(kg·d)+ZnPP注射液1 mg/(kg·d)腹腔注射。各組每日上午給藥1次，療程為4周。檢測4組大鼠心肌組織HO-1mRNA基因表達，觀察大鼠心肌組織結構變化。結果 TanⅡA組HO-1 mRNA基因表達高于其余3組(均P<0.01)，當使用HO-1抑制劑ZnPP注射液后可見HO-1 mRNA基因表達較TanIIA明顯下降(P<0.01)。光鏡下假手術組大鼠心肌纖維排列整齊、橫紋明顯，胞核結構清晰，無壞死灶，心肌間質及微血管正常；與假手術組比較，模型組心肌纖維明顯增粗且排列紊亂，部分胞核固縮，并有局灶性、片狀壞死灶和炎性細胞浸潤，血管周圍及間質有膠原纖維的沉積；TanIIA組和TanIIA+ZnPP組心肌的組織形態學均有不同程度改善，而TanIIA組改善更明顯。結論 TanⅡA可以抑制心肌纖維化，減緩心室重構，此作用可能與TanIIA誘導HO-1過表達有關。

疾病模型，動物；心肌；丹參酮；血紅素加氧酶-1；心室重構

丹參酮ⅡA (TanshinoneⅡA，TanⅡA)作為傳統中藥丹參中脂溶性成分的基本結構，具有清除自由基、抗氧化、抑制膠原纖維產生、促進纖維蛋白降解、減輕心肌缺血再灌注損傷、抑制血小板凝聚和血栓形成等多項作用[1-2]。然而，TanⅡA這種保護作用的分子機制尚不明確[3]。血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)作為血紅素分解代謝的關鍵酶，HO-1作為其誘導型酶，具有明顯的保護器官和組織等作用[4]，TanⅡA是否可以通過誘導HO-1的過表達，起到保護細胞的作用，目前尚未見報道。本研究擬通過建立壓力超負荷大鼠模型，探討TanⅡA和HO-1 mRNA基因表達之間的關系及TanⅡA對壓力超負荷大鼠心室重構的影響，以期為延緩心室重構提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠40只，6周齡，體質量180～200 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(滬)2013-0016。動物房溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，光照時間8：00～20：00，保持實驗室內通風良好。飼料、墊料高壓滅菌處理，常規給予飼料喂養，保持所有大鼠自由進食、飲水。

1.1.2 試劑與藥品 Trizol購自美國Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；SYBR熒光染料試劑購自日本 TOYOBO公司；Agarose購自西班牙Biowest公司；氯仿、異丙醇、10%水合氯醛、10%甲醛均購自南京化學試劑股份有限公司；丹參酮ⅡA磺酸鈉(STS)注射液(2 mL:10 mg)購自上海第一生化藥業有限公司；鋅原卟啉(ZnPP)注射液購自美國 Sigma公司。

1.2 實驗方法1.2.1 壓力超負荷大鼠模型制備 將40只SD大鼠常規飼養1周后，按照隨機數字表法給大鼠編號，8只為假手術組，其余32只為手術組，手術組大鼠術前禁食12 h，先將SD大鼠用濃液10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)行腹腔注射麻醉，后采用腹主動脈縮窄法制備壓力超負荷模型，術后6 h恢復飲食。術后3 d內給予注射用青霉素鈉腹腔注射(4 000 U/kg)預防感染。假手術組除不結扎腹主動脈外，余處理同手術組。術后3 d，檢測尾動脈血壓，血壓較前升高20%視為造模成功，連續觀察4周。1.2.2 分組及給藥 造模4周后，手術組大鼠共死亡10只，主要死因為急性心力衰竭，假手術組(n=8)全部存活。將術后存活的手術組大鼠按隨機數字表法分為模型組(n=7)、TanⅡA組(n=7)及TanⅡA組+HO-1抑制劑組(TanⅡA+ZnPP組，n=8)。假手術組、模型組均以0.9%氯化鈉注射液4 mL/(kg·d)腹腔注射；TanⅡA組以STS注射液20 mg/(kg·d)腹腔注射；TanⅡA+ZnPP組以STS注射液20 mg/(kg·d)+ZnPP注射液1 mg/(kg·d)腹腔注射。各組每日上午給藥1次，連續給藥4周，觀察大鼠的飲食、活動、精神、毛色及水腫等情況，每周稱取體質量1～2次。 1.2.3 觀察指標 觀察4組大鼠心肌組織HO-1 mRNA基因表達及大鼠心肌組織結構變化。

1.2.4 HO-1 mRNA的實時定量PCR檢測 取心肌組織40 mg加入Trizol液1 mL，按Trizol試劑說明書進行抽提總RNA，測定RNA濃度和純度，逆轉錄cDNA，以Real-time PCR技術檢測心肌組織中HO-1的表達水平，總的反應體系20 μL：2X Real-time PCR Master Mix(SYBR Green)10 μL、模板(cDNA稀釋10倍)1 μL、引物MIX( F/ R各為10 μm)2 μL、0.1%二乙基焦磷酰胺(DEPC水) 7 μL。在PCR反應體系中，一個樣本基因做3個復孔。目的基因大鼠HO-1正義引物5'- GTAAAGCGTCTCCACGAGGT -3'，反義引物5'- ACCCAGGTAGCGGGTATATG -3'，擴增片段長度為75 bp。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)正義引物5'- GGCCTTCCGTGTTCCTACC -3'，反義引物5'- CGCCTGCTTCACCACCTTC -3'，擴增片段長度為103 bp。細胞內mRNA表達水平以相應標本內GAPDH mRNA為基準采用2^-△△CT方法計算，并將假手術組標本內目的基因表達水平設為1，對其他組標本內目的基因表達水平進行標準化。

1.2.5 心臟病理組織學檢測 左室心肌標本于10%甲醛溶液中固定24 h后，常規取材、脫水、石蠟包埋，沿左室長軸線每隔1 mm橫斷面切取數張厚約4 μm的組織切片，行蘇木精-伊紅染色法(HE)染色。在光學顯微鏡下觀察各組心肌細胞形態。

2 結 果

2.1 4組大鼠心肌組織HO-1mRNA基因表達的比較 見表1、圖1-2。

組 別n2^-△△CT假手術組81.00±0.04*模型組75.98±0.40*TanⅡA組78.35±0.34TanⅡA+ZnPP組82.50±0.05*

與TanⅡA組比較，*P<0.01

HO-1線性擴增圖譜

GAPDH線性擴增圖譜

HO-1對數擴增圖譜

GAPDH對數擴增圖譜

HO-1熔解曲線 GAPDH熔解曲線

圖1 各組大鼠心肌組織HO-1 mRNA與GAPDH的線性、對數擴增圖譜及熔解曲線

圖2 各組大鼠心肌組織HO-1 mRNA基因表達水平比較

由表1及圖1、2可見，采用Real-time PCR技術，檢測各組大鼠心肌組織HO-1 mRNA擴增CT值，通過2^-△△CT計算目的基因含量。從擴增的熒光曲線及熔解曲線可以看出，曲線大部分擬合良好，CT值接近，說明PCR體系穩定、模板分配均勻、樣品的重復性較好，擴增效率基本一致，結果可靠。TanⅡA組HO-1 mRNA基因表達高于其余3組(均P<0.01)，當使用HO-1抑制劑ZnPP注射液后可見HO-1 mRNA基因表達較TanⅡA明顯下降(P<0.01)。

2.2 4組大鼠心肌組織結構變化比較 見圖3。

圖3 4組大鼠心肌組織結構變化(HE，×200)

由圖3可見，假手術組大鼠心肌纖維排列整齊、橫紋明顯，胞核結構清晰，無壞死灶，心肌間質及微血管正常；與假手術組比較，模型組心肌纖維明顯增粗且排列紊亂，部分胞核固縮，并有局灶性、片狀壞死灶和炎性細胞浸潤，血管周圍及間質有膠原纖維的沉積；TanⅡA組和TanⅡA+ZnPP組心肌的組織形態學均有不同程度改善，而TanⅡA組改善更明顯。

3 討 論

心室重構是指心肌對容量或壓力超負荷引起的代償性、適應性改變，包括心肌細胞肥大、間質纖維化和細胞凋亡等，逐步進展為心力衰竭。心室重構的發生不僅表現為幾何形態學改變，也體現在細胞間信號傳導、細胞外基質及基因表達改變上，是許多嚴重心血管疾病末期的共同通路。而氧化應激在心室重構的發生發展過程中發揮著重要作用，活性氧可以通過多種途徑促進心肌肥厚、間質纖維化和心肌細胞凋亡，從而導致心室重構。

近年來研究發現，許多中藥對抑制心室重構具有保護作用[5-6]，我國學者從中藥中篩選出高效低毒的藥物以減少壓力超負荷引起的心室重構損害，丹參便是其中之一。研究表明，丹參具有清除氧化自由基、抑制炎癥反應、改善血液動力學及微循環、有效減輕器官的缺血再灌注損傷等作用，TanⅡA是丹參中含量最豐富、結構最具代表性的丹參酮，可通過降低還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性，減少活性氧產生，減弱氧化應激，從而有效抑制大鼠心室重構的發展[7-8]。

HO系統是血紅蛋白降解的起始酶和最重要的限速酶，與心血管疾病有著密切聯系[9]。它主要有3種同工酶：HO-1、HO-2和HO-3，其中以誘導型酶HO-1作用最為顯著，HO-1位于人染色體22q12，相對分子量為32 000，可以通過轉化血紅素產生一氧化碳(CO)、鐵離子和膽綠素[10]，主要分布于單核細胞胞質微粒體，在網狀內皮細胞含量豐富的組織如肝、脾等也有少量分布。生理條件下HO-1表達水平很低，但可被多種有害刺激所誘導，包括氧化應激、炎癥、熱休克、重金屬、高溫及內毒素等[11]。Zeng B等[12]研究發現HO-1在間充質干細胞(MSCs)過表達影響血管生成和改善心肌梗死后心肌功能，與對照組比較，HO-1-MSCs組凋亡細胞明顯減少，左室擴張度和纖維化程度均顯著降低，左室前壁厚度更薄。超聲心動圖結果進一步證實了HO-1可通過修飾MSCs顯著改善左室重構。Allwood MA等[13]研究證實在急性壓力情況下HO-1的表達升高對細胞有明確的保護作用，HO-1酶活性減弱氧化應激和炎癥，促進新血管形成，并與心血管疾病的發生發展呈負相關。通過研究HO-1基因敲除小鼠模型和HO-1缺失患者進一步支持了HO-1對心肌細胞的保護作用。Tiwari S 等[14]研究表明HO-1缺乏與氧化應激增加和相關病理結果聯系密切。與對照組比較，HO-1基因敲除小鼠隨著慢性缺氧右心室嚴重擴大。另外，HO-1缺失的胚胎成纖維細胞更易受氧化刺激增加損傷和死亡，從而證明了HO-1在氧化應激中的有益作用。目前丹參和HO-1的關系研究國內外報道較少，Chen TH等[15]實驗證明，TanⅡA 可以誘導RAW264.7巨噬細胞內HO-1過表達，其抗炎作用可能是通過其誘導HO-1過表達實現的。

本實驗研究結果表明，TanⅡA組的HO-1 mRNA的基因表達明顯高于其余3組，表明TanⅡA對大鼠心肌組織細胞HO-1的表達有明顯的誘導作用，病理切片結果顯示，TanⅡA組心肌纖維化程度較模型組明顯改善。用HO-1抑制劑ZnPP注射液按1 mg/(kg·d)腹腔注射作對照，結果發現HO-1 mRNA的表達明顯降低，HE染色結果顯示心肌纖維化程度改善程度不如TanⅡA組明顯，說明TanⅡA有保護心肌細胞、抑制心肌纖維化、延長心室重構的作用。當ZnPP抑制了HO-1的過表達后，TanⅡA對心肌細胞的保護作用減弱。相關性分析結果表明，當HO-1表達與心肌纖維化程度呈負相關時，TanⅡA在大鼠心室重構中的保護作用是通過對HO-1的誘導來實現的。

綜上所述，TanⅡA對大鼠壓力超負荷引起的心肌纖維化具有明顯的效果，可以延緩大鼠心室重構的時間。其作用除了抑制心肌細胞肥大、減弱氧化應激、抑制信號通路外，還可能與誘導HO-1的過表達，通過HO-1來實現這種保護作用有關。本實驗以期為臨床心室重構時間的延長提供實驗依據，為開發新藥提供理論基礎。

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(本文編輯：習 沙)

Study of Tanshinone-IIA on the expression of myocardium hemo oxygenase-1 mRNA in pressure-overloaded rats

CAIHui,ZHUKaiyuan,ZHAOLingjie,etal.

DepartmentofIntegratedChineseandWesternMedicines,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommandofPLA,Jiangsu,Nanjing210002

Objective To observe the Tanshinone-IIA (TanIIA) on the expression of myocardium hemo oxygenase-1 (HO-1) mRNA in pressure-overloaded rats, and to investigate its protection of myocardial fibrosis and ventricular remodeling. Methods 40 SD rats were randomly selected 8 for control (sham group), the remaining 32 rats were prepared for abdominal aortic constriction pressure-overloaded model. Postoperative survival 22 rats were randomly divided into model group (n=7), TanIIA group (n=7) and TanIIA+HO-1 inhibitor group (TanIIA+ZnPP group,n=8). Four weeks after the operation, the model was successfully made and began to give medicine for four weeks.The sham group and the model group received intraperitoneal injection of 0.9% sodium chloride injection (4mL·kg·d).The TanⅡA group received intraperitoneal injection of TanⅡA sulfonate sodium injection (20mg·kg·d). The TanⅡA +ZnPP group received TanⅡA sulfonate sodium injection (20mg·kg·d) combined with ZnPP injection (1mg·kg·d).The expression of HO-1 mRNA in myocardium was detected, and the pathological HE staining was done at the same time. Results The expression of HO-1 mRNA in TanIIA group was higher than the other three groups (P<0.01). The expression of HO-1 mRNA in TanIIA+ZnPP group was obviously decreased as compared with TanIIA group (P<0.01). Myocardial fibrosis in sham operation group arranged irregularly, visible cross striations, clear nuclei, without necrosed tissue, and with normal myocardial interstitium and micrangium. As compared with the sham operation group, the myocardial fibrosis in model group became denser and malalignment, some nucleolus shrinked, with focal and patchy necrosis, inflammatory cell infiltration, deposition of collagen fibers around vessel and mesenchyme.There were different improvements of myocardial tissue morphology in TanIIA and TanIIA+ZnPP group, and the improvement in TanIIA group was more obvious. Conclusion TanIIA can inhibit myocardial fibrosis and reduce ventricular remodeling, which may be related with the TanIIA-induced over-expression of HO-1.

Disease models; Animals; Myocardial; Tanshinone; Hemo oxygenase-1; Ventricular remodeling

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.09.018

※ 項目來源：南京總醫院科研基金面上課題(編號：2014016)

蔡輝(1959—)，男，教授，博士。從事中西醫結合臨床研究工作。

R-332；R-33；R284.1

A

1002-2619(2016)09-1348-05

2016-02-26)