牛蒡低聚果糖對A-ED大鼠組織NOSmRNA表達的影響

孟 宇，呂 俊，凌烈峰，高家林

(1.皖南醫學院 生物化學研究室，安徽 蕪湖241002；2.活性生物大分子研究安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241002)

?

牛蒡低聚果糖對A-ED大鼠組織NOSmRNA表達的影響

孟 宇1，2，呂 俊1，2，凌烈峰1，2，高家林2

(1.皖南醫學院 生物化學研究室，安徽 蕪湖241002；2.活性生物大分子研究安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241002)

目的:探討牛蒡低聚果糖對大鼠動脈性勃起功能障礙(A-ED)治療作用的機理.方法:利用RT-PCR方法檢測經灌胃給藥后的A-ED大鼠陰莖組織和睪丸組織中三種亞型NOSmRNA的表達．結果：牛蒡低聚果糖10g/kg和20g/kg能提高A-ED大鼠陰莖組織神經型一氧化氮合酶(nNOS)和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的表達水平；牛蒡低聚果糖10g/kg和20g/kg灌胃后,與模型組比較,能增加睪丸組織中nNOS和eNOS基因表達(P<0.01)．結論:牛蒡低聚果糖能顯著上調nNOS和eNOS基因的表達,使得NO的合成增加，從而影響大鼠的勃起功能．

牛蒡低聚果糖；A-ED大鼠；NOS基因表達

勃起功能障礙(erectile eysfunction，ED)近年發病有所增加，動脈性ED(A-ED)是血管性ED的一種,也是常見的ED，治療現狀不是很樂觀，藥物短暫緩解病情，并不能從根本上治療ED病．NOS(一氧化氮合酶)在ED病的發生和發展中起著重要作用，本實驗通過檢測牛蒡根化學成分牛蒡低聚果糖對動脈性ED大鼠陰莖組織和睪丸組織中三種亞型NOSmRNA表達的變化，從而進一步探索其治療ED病的可能機制．

1 材料

1.1 實驗動物

SD大鼠全部雄性32只，成熟，體重在180g左右，由皖南醫學院動物房提供，分籠飼養，保證籠內衛生，溫度穩定在25℃，自由取水、飲食．

1.2 藥品和試劑

牛蒡低聚果糖由南京凱基生物有限公司購買；Trizol總RNA提取試劑，合肥志宏生物有限公司購買，RT-PCR試劑盒，合肥志宏生物有限公司購買．

2 實驗方法

2.1 分組和模型的建立

將32只雄性SD大鼠，隨機分成4組：假手術組(給予等量的蒸餾水)；模型組；牛蒡根低聚果糖10g/kg組、20g/kg組．髂內動脈結扎處理模型組及給藥組，用0.4%的戊巴比妥鈉腹腔注射大鼠進行麻醉后，正中切開下腹部皮膚、皮下組織，剪開腹膜后進入腹腔，在髂總動脈分叉處找到左髂總動脈，深處找到左髂內動脈，在其起始處用線結扎左右髂內動脈．假手術組打開腹腔后，即縫合腹部不做髂內動脈結扎．造模后每天給藥一次，連續給藥28天．

2.2 RNA的提取

取出模型組和給藥組的陰莖組織和睪丸組織各100mg，液氮罐中磨碎成粉末，用Trizol一步提取法提取細胞總RNA，操作按照試劑盒說明書進行．

2.3 RNA濃度和純度的測定

取RNA樣品用緩沖液稀釋樣品100倍，測定樣品在260nm和280nm的吸收值來確定RNA的質量．按公式計算：RNA的濃度=OD260×稀釋倍數×0.04μg/μL，OD260/280在1.8～2.1視為RNA純度高．

2.4 逆轉錄實驗

按要求在經過滅菌和無核糖核酸酶處理的PCR管中加入RNA、Oligo dT(18)、RNase抑制劑、Buffer2.5μL、dNTPs、DTT(1M)、逆轉錄酶(AMV)，無核酸酶的雙蒸水等反應所需物質后，經過離心，保溫、冰浴等步驟后，得到產物，-20℃進行保存．

2.5 逆轉錄產物的擴增

取上步產物在PCR擴增儀器上進行擴增，以β-actin為內參照物．取逆轉錄產物2μL，加入25μL反應體系．β-actin反應及三種亞型NOS的反應均經過預變性95℃ 5s，95℃變性30s,55℃復性30s,72℃延伸35s，30個循環；72℃延伸10s；反應完成后，取反應產物5μL進行瓊脂糖凝膠電泳以確定產物是否為擴增產物．最后對反應結果進行吸光度(A)掃描，用目的基因β-actin的相對面積灰度值來表示其結果．

3 實驗結果

3.1 牛蒡低聚果糖對A-ED大鼠陰莖組織中3種NOS亞型基因表達水平的影響

牛蒡低聚果糖對A-ED大鼠陰莖組織中3種NOS亞型基因表達水平的影響結果見圖1、表1，由表1可知，牛蒡低聚果糖10g/kg和20g/kg能明顯提高A-ED大鼠陰莖組織nNOS和eNOS基因表達水平，牛蒡低聚果糖20g/kg能夠顯著提高nNOS和eNOS基因表達；其凝膠電泳圖，如圖1所示.

表1 牛蒡低聚果糖對A-ED大鼠陰莖組織中3種NOS亞型基因表達的影響

注：模型組與假手術組比較△p<0.05,△△p<0.01；給藥組與模型組比較，*p<0.05,**p<0.01

3.2 牛蒡低聚果糖對A-ED大鼠睪組丸組織中3種NOS亞型基因表達水平的影響

牛蒡低聚果糖對A-ED大鼠睪丸組織中3種NOS亞型基因表達水平的影響結果，如表2所示，由表2可知，經牛蒡低聚果糖10g/kg和20g/kg灌胃后，與模型組比較，能明顯增加nNOS、eNOS基因表達(P<0.05)．其電泳圖，如圖1所示.

表2 牛蒡低聚果糖對A-ED大鼠睪丸組織中3種NOS亞型基因表達水平的影響±s)

注：模型組與假手術組比較△p<0.05,△△p<0.01；給藥組與模型組比較，*p<0.05,**p<0.01

圖1 牛蒡低聚果糖對A-ED大鼠睪丸和陰莖組織三種亞型NOS基因表達電泳圖

1.模型組睪丸組織；2.模型組陰莖組織；3.假手術組睪丸組織；4.假手術組陰莖組織；5.牛蒡低聚果糖10g/kg組睪丸組織；6.牛蒡低聚果糖20g/kg組睪丸組織；7.牛蒡低聚果糖10g/kg陰莖組織；8.牛蒡低聚果糖20g/kg陰莖組織

4 討論

關于陰莖勃起機制的研究，L-Arg-NO-cGMP信號通路這個機制已經被大家所認可．作為合成NOS的關鍵酶，NOS在陰莖勃起的起始階段具有重要作用．NOS包括神經型(nNOS)、內皮型(eNOS)和誘導型(iNOS)三種類型．NOS主要分布在陰莖海綿體的神經以及平滑肌上，它在介導陰莖平滑肌松弛過程中起著關鍵作用，NO作為一種神經遞質在平滑肌松弛的信號傳導通路中發揮重要作用．研究陰莖組織和睪丸組織中信號分子NO的含量，對勃起功能障礙的病理生理學以及開發治療勃起功能障礙新藥物具有重要意義．血管性ED是常見類型．動脈性ED是血管性ED的一種，陰莖動脈供血不足，是ED病發生的最常見原因之一．國外學者采用結扎雙側髂內動脈的方法建立了A-ED模型．缺血缺氧后導致固有型NO產生減少，使信號傳導功能降低，從而導致陰莖海綿體舒張功能降低．通過大鼠雙側髂內動脈結扎建立了動脈性ED模型，動脈性ED模型組三個NOS亞型的mRNA表達明顯降低，說明該模型可以作為缺血性ED研究的模型．也提示雙側髂內動脈結扎除了引起海綿體結構和功能損傷外，降低NOS的表達，影響NO-cGMP信號通路功能可能是A-ED的發病機制．

前期實驗已經證明牛蒡低聚果糖能夠改善ED癥狀，但機制并不是很明確．本實驗經過28天的不同劑量的牛蒡低聚果糖灌胃給藥后，RT-PCR實驗結果表明牛蒡低聚果糖顯著上調nNOS和eNOS基因的表達，從而使得NO的合成增加．進而影響NO-cGMP通路，介導平滑肌松弛，促使陰莖勃起，來改善勃起功能障礙．

由此可見，牛蒡根化學成分牛蒡低聚果糖促使NOS表達的增加可能是改善A-ED大鼠的勃起功能的主要機制，后期實驗將繼續研究．

[1]Seyam RM，Huynh HT,Brock GB.Neuronal and endothelial nitric oxide synthase isoforms：quantification of protein and mRNA in the normol rat penis[J].Int J Impot Res,1999(11):301-308．

[2]Tanji N，Markowitz G S，Fu C，et a1．Expression of advanced glycation end products and their cellular receptor RAGE in diabetic nephropathy and non-diabetic renal disease[J].J Am Soc Nephrol,2000,l1(2):1656-1666．

[3]Bierhaus A，Hofmann M A，Ziegler R，et a1．AGEs and their interaction with AGE-receptors in vascular disease and disbters,I,the AGE concept[J].Cardiotasc Res,1998,37(3):586.

[4]Rajasekaran M，Moadal D，Sikka S．Ex vivo expression nitric oxide synthase isofomsm(eNOS/iNOS)and calmodulin in human penile cavernosal cells[J].J Urol,1998,160(6):2210-2215.

[5]Chancellor MB,TirneyS,Mattes CE,et al.Nitric oxide synthsse gene transfer for erectile dysfunction in a.rat model[J].BJN International,2003,91(7):691-694.

[6]Seyam RM,Huynth HT,Brock GB.Neuronal and endothelial nitric oxidw syhnthase isofoms:quantification of protein and mRNAin the normal rat penis[J].Int J Impot Res,1999,11(6):301-308.

[7]Garban H,Marquez D,Magee T,et al.Cloning of rat and human inducible penile nitric oxide synthase.Application for gene therapy of erectile dysfunction[J].Biol Reprod,1997,56(4):954-963.

[8]JIN L,BURNETT AL.NADPH oxidase:recent evidence for its role in erctile dysfunction[J].Asian J Androl,2008,10(1):6-13.

[9]Simky MB,Azadzoi KM.Vasculogenic Erectile Dysfunction：Newer Thempeutic Strategies[J].J Urol,2003,170: 24-30．

[10]E1 Salcka, A Yen TS，Lin CS, et a1.Traumatic artefiogenic erectile dysfunction:a rat model[J]. Int J Impot Res,200l,13:162-171．

(責任編輯:陳衍峰)

10.13877/j.cnki.cn22-1284.2016.08.021

2015-10-12

國家自然科學基金“溶酶體膜蛋白sidt2對胰島素顆粒分泌的影響的作用機制研究”(81200632)；安徽省自然科學基金“探索溶酶體膜蛋白sidt2 在胰島素分泌過程中的作用機制”(1308085QH134)；活性生物大分子研究安徽省級重點實驗室項目(LAB201401)

孟宇,女,安徽臨泉人,教師.

Q95-3

A

1008-7974(2016)04-0063-03