純康血脂膠囊對高脂血癥大鼠肝臟黏附分子表達的影響

牛慧云，田彩云，楊玉梅，杜志強，任志生，杜曉紅

（1.包頭醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院藥劑科，內蒙古 包頭 014030；

2.包頭醫(yī)學院藥學院·心血管研究室，內蒙古 包頭 014040）

純康血脂膠囊對高脂血癥大鼠肝臟黏附分子表達的影響

牛慧云1，田彩云2，楊玉梅2，杜志強1，任志生1，杜曉紅1

（1.包頭醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院藥劑科，內蒙古 包頭 014030；

2.包頭醫(yī)學院藥學院·心血管研究室，內蒙古 包頭 014040）

目的 探討純康血脂膠囊對高脂血癥大鼠肝臟細胞間黏附分子（ICAM-1）、血管細胞黏附分子（VCAM-1）mRNA表達的影響。方法 將健康雄性SD大鼠40只隨機分為4組，即空白組、模型組、辛伐他汀組及純康血脂膠囊組，每組10只。高脂飼料飼喂3周建立高脂血癥動物模型，純康血脂膠囊組灌胃純康血脂膠囊（0.5 g/kg），辛伐他汀組灌胃辛伐他汀混懸液（12 mg/kg），空白組、模型組灌胃等容量生理鹽水，共9周。檢測血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），采用半定量RT-PCR法測定大鼠肝臟ICAM-1，VCAM-1 mRNA的表達。結果 與模型組比較，純康血脂膠囊組大鼠血清TC，TG，LDL-C水平顯著降低（P＜0.05），肝臟ICAM-1，VCAM-1 mRNA表達均顯著減弱（P＜0.01）。結論 純康血脂膠囊可通過下調肝臟ICAM-1，VCAM-1 mRNA表達，調節(jié)高脂血癥大鼠血脂水平。

純康血脂膠囊；高脂血癥；肝臟細胞間黏附分子；血管細胞黏附分子

高脂血癥是引起心腦血管疾病的主要原因之一。目前，中藥調血脂藥物以其藥源豐富、調脂作用溫和、毒副作用小等優(yōu)點，在高脂血癥的防治中發(fā)揮著重要作用［1］。近年來，對高脂血癥的試驗研究已從簡單的改善血脂異常涉及到分子水平。細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）屬免疫球蛋白超家族的細胞黏附分子，是介導細胞與細胞、細胞與基質之間相互作用的糖蛋白，參與眾多的病理生理過程，在炎癥發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用［2-4］。純康血脂膠囊主要由蓽茇、大黃、粉葛、蒲黃、何首烏等組方，是內蒙古蒙藥技術研究工程中心研制的中藥制劑。本研究中從分子水平探討純康血脂膠囊對試驗性高脂血癥大鼠肝臟ICAM-1及VCAM-1 mRNA表達的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、動物與試藥

儀器與試劑：TG16-WS型臺式高速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；PTC-100TM型 PCR儀 Programmable Thermal Controller.MJ Research，InC）；Motic 6.0數碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)（廈門麥克奧迪儀器儀表有限公司）。RT-PCR反轉錄試劑盒（Invitrogen，批號為 11904-018）；Taq酶（TaKaRa，批號為 R001A）；PCR試劑盒（TaKaRa）；TRIzol試劑盒（Invitrogen，批號為15596-026）。

動物：SPF級雄性SD大鼠40只，體質量（200±50）g，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所提供，動物許可證號為SCXK（京）2009-0017。

藥品：純康血脂膠囊（內蒙古蒙藥技術研究工程中心，批號為051012）；辛伐他汀片（蘇州俞氏藥業(yè)有限公司，批號為120107）。

1.2 模型建立

SD大鼠適應性飼養(yǎng)2 d后，隨機分成4組，空白組、模型組、純康血脂膠囊組、辛伐他汀組，除空白組給予普通飼料外，各組大鼠均喂飼高脂飼料，即膽固醇（4%）、膽酸鹽（1%）、豬油（10%）、甲基硫氧嘧啶（0.2%）和基礎飼料（84.8%），自由飲水，連續(xù)3周。

1.3 給藥方法

造模成功后，繼續(xù)喂飼高脂飼料并灌胃給藥（20 mL/kg），每天1次，連續(xù)9周，純康血脂膠囊內容物、辛伐他汀片分別用生理鹽水溶解配成質量濃度為0.5 g/kg（相當于人臨床等效量）、12 mg/kg（相當于人臨床用量的20倍）的混懸液，正常對照組與高脂模型組給予等容量生理鹽水，每周稱量體重并按體重調整用藥量。

1.4 血清血脂水平的測定

末次給藥后禁食12 h，戊巴比妥鈉麻醉后腹主動脈取血5 mL，以3 000 r/min的速率離心10 min，分離血清備用，按說明書測定血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

1.5 肝臟ICAM-1及VCAM-1 mRNA表達的測定

末次給藥后禁食12 h，放血處死大鼠，迅速解剖取出肝臟，于冷生理鹽水中去除血液，同一位置切取一小部分肝臟置無RNA酶的凍存管中，液氮速凍后于-70℃冰箱凍存。

總RNA提取：相同部位取冷凍肝組織約100 mg加1 mL Trizol試劑勻漿，按 Trizol試劑操作方法提取總RNA用于逆轉錄，各總 RNA樣本 A260/A280比值為1.8～2.0。

PCR擴增反應：1）RT-PCR擴增反應體系。結果見表1。2）RT-PCR擴增反應條件。95℃預變性3min→35個循環(huán)（95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s）→72℃終末延伸10 min。

表1 RT-PCR擴增反應體系

電泳：取PCR產物約8 μL，以1%瓊脂糖凝膠電泳20～30 min，紫外燈下觀察目的條帶，凝膠成像分析系統(tǒng)成像后進行灰度掃描，以β-actin密度作為參考定量標準計算ICAM-1及VCAM-1 mRNA表達的相對量。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數資料用均數±標準差（）表示，組間比較用獨立樣本 t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對大鼠血脂的影響

與空白組相比，模型組血清TC，TG，LDL-C均顯著升高，HDL-C顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，純康血脂膠囊組和辛伐他汀組TC，TG，LDL-C均顯著降低，HDL-C顯著升高（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠血脂水平比較（，mmol/L，n=10）

表2 各組大鼠血脂水平比較（，mmol/L，n=10）

注：與空白組比較，#P＜0.01；與模型組比較， P＜0.01。下表同。

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2.2 對ICAM-1，VCAM-1 mRNA的影響

由表3及圖1可見，與正常對照組比較，高脂模型組ICAM-1，VCAM-1 mRNA表達均顯著增強（P＜0.01）。與高脂模型組比較，純康血脂膠囊組和辛伐他汀組ICAM-1，VCAM-1 mRNA表達均顯著減弱（P＜0.01）。ICAM-1 cDNA，VCAM-1 cDNA PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。

表3 各組高脂血癥大鼠肝組織ICAM-1，VCAM-1表達情況比較（， -action，n=10）

表3 各組高脂血癥大鼠肝組織ICAM-1，VCAM-1表達情況比較（， -action，n=10）

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3 討論

目前，對高脂血癥作用機理及病理生理的研究已深入到細胞和分子生物學水平。細胞黏附分子是一類由細胞產生的可介導細胞間、細胞與基質間的黏附的糖蛋白，以配體-受體相對應的形式發(fā)揮信息傳遞和受體功能的作用［5］。細胞黏附分子參與細胞信號的傳導與活化、炎性反應、創(chuàng)傷愈合、血栓形成等一系列生理、病理過程。ICAM-1和VCAM-1在冠心病等病理過程中起著重要作用，細胞活化時，ICAM-1和VCAM-1的表達迅速上升，使內皮細胞易于“捕獲”炎性細胞，并促進其遷入動脈壁，促進斑塊內炎性反應。ICAM-1和VCAM-1通過介導白細胞、內皮細胞、單核細胞和T細胞的滾動和穩(wěn)定黏附，在單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等炎性因子的協助下穿越血管表層，啟動局部的炎性反應［6］。

圖1 基因電泳圖

正常肝細胞不表達ICAM-1，竇內皮細胞和血管內皮細胞有微弱表達，VCAM-1可在內皮細胞特別是在細胞激動素刺激下在血管內皮上表達［7-8］，肝損傷時內皮細胞性粒細胞（PMN）介導細胞毒的主要物質，中性粒細胞與肝細胞ICAM-1黏附，通過釋放氧自由基和蛋白酶發(fā)揮細胞毒作用，從而導致肝細胞壞死［9-10］。

高脂血癥時肝內過量脂肪堆積、脂質過氧化、脂毒性反應和體內內毒素血癥等激活肝星狀細胞，促使其表達、合成和分泌腫瘤壞死因子等細胞因子，通過改變核轉錄因子-KB和蛋白激酶相關機制，使ICAM-1在肝內的表達上調［11］。反之，ICAM-1缺失或低表達可抑制中性粒細胞向肝細胞的黏附，從而減少肝細胞的損傷，研究證實，ICAM-1的表達水平與肝臟炎癥嚴重程度呈正相關［12］。

VCAM-1廣泛分布于細胞因子活化的內皮細胞、上皮細胞、單核巨噬細胞及樹突狀細胞表面，炎癥病理條件下其表達增多。VCAM-1通過與其特定配體VLA-4結合參與白細胞對內皮細胞的黏附，促進中性粒細胞、單核細胞及T淋巴細胞浸入肝實質，與炎癥的發(fā)生及發(fā)展有密切關系［13］。VCAM-1的水平可反映血管內皮細胞的激活狀態(tài)。研究顯示，VCAM-1獨立于經典的高危因素，是預測心血管病未來病死率最為顯著而獨立的標記物［14-15］。VCAM-1可能不僅促進中性粒細胞，而且也促進單核細胞及T淋巴細胞浸入肝實質，與炎癥的發(fā)生及發(fā)展有密切關系。研究證明，不穩(wěn)定型心絞痛及心肌梗死患者ICAM-1和VCAM-1的表達明顯高于穩(wěn)定型心絞痛患者，因此ICAM-1和VCAM-1表達水平與冠心病的嚴重程度相關［16］。大劑量他汀類藥物可以降低黏附分子水平，使內皮細胞不易“捕獲”白細胞，減少黏附分子介導的白細胞反應，減少血管壁和動脈粥樣斑塊的單核巨噬細胞浸潤，增加纖維帽的穩(wěn)定性，從而減緩斑塊破裂的反應［17］。

綜上所述，純康血脂膠囊可顯著降低高脂血癥大鼠肝臟ICAM-1，VCAM-1表達，且降低VCAM-1表達與辛伐他汀無顯著差異，提示純康血脂膠囊可通過降低ICAM-1，VCAM-1在肝臟的表達，抑制中性粒細胞與肝細胞的黏附，從而發(fā)揮調節(jié)血脂的作用。

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Effect on the Expression of Adhesion Molecule in Hyperlipemic Rats Treated with Chunkang Xuezhi Capsules

Niu Huiyun1，Tian Caiyun2，Yang Yumei2，Du Zhiqiang1，Ren Zhisheng1，Du Xiaohong1
（1.Department of Pharmacy，The Third Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou，Neimenggu，China 014030； 2.Department of cardiovascular research，school of pharmacy，Bao Tou Medical College，Baotou，Neimenggu，China 014030）

Objective To investigate the effect of Chunkang Xuezhi Capsules on ICAM-1 and VCAM-1 mRNA expression of hyperlipemic rats.M ethods 40 Wistar male rats were divided into 4 groups（10 rats in each group）randomly：blank group，model group，simvastatin group and Chunkang Xuezhi Capsules group.Hyperlipidemic rats were induced by hyperlipidemic diet for 3 weeks.The Chunkang Xuezhi Capsules group was intragastric administrated with Chunkangxuezhi suspensionl（0.5 g/kg daily），the simvastatin group was intragastric administrated with simvastatin suspension（12 mg/kg daily），and the rats in the blank group and the model group were intragastric administrated with equal volume of saline for 9 weeks.The expressions of ICAM-1 and VCAM-1 in hepatic tissue were measured by semi-quantitative RT-PCR.Results The serum levels of TC，TG and LDL-C in the Chunkang Xuezhi Capsules group were significantly lower than those in the model group（P＜0.05），the expressions of ICAM-1 and VCAM-1 significantly lower than those in the model group（all P＜0.01）.Conclusion Chunkang Xuezhi Capsules can regulate the blood lipid levels of hyperlipidemic rats by reducing the expressions of ICAM-1and VCAM-1.

Chunkang Xuezhi Capsules；hyperlipidemias；ICAM-1；VCAM-1

R285．5；R286

A

1006－4931（2016）19－0033－04

牛慧云（1981-），女，漢族，碩士研究生，主要從事臨床藥學和藥理學研究工作，（電子信箱）bfyyyjkzr@163.com；楊玉梅，碩士研究生，主要從事臨床藥學和藥理學研究工作，本文通訊作者，（電子信箱）yym457@aliyun.com。

2016-06-01；

2016-07-03）