熱補針法干預風濕性關節炎寒證模型家兔尿液代謝組學研究?

袁博 王金海 張星華 田亮 任朝展 杜小正

摘要：目的 通過對風濕性關節炎（RA）寒證模型家兔尿液中內源性代謝物的分析，探討熱補針法治療RA的特異性機制。方法 采用卵蛋白誘導聯合低溫冷凍建立RA寒證家兔模型。將40只清潔級青紫藍家兔隨機分為正常組、模型組、平補平瀉組、捻轉補法組、熱補針法組，每組8只。分別應用平補平瀉、捻轉補法、熱補針法針刺“足三里”，1次/d，留針30 min，共7 d。干預結束后收集新鮮尿液，氣相色譜-四級桿飛行時間質譜采集各組尿液代謝物圖譜，利用主成分分析和偏最小二乘判別分析對數據進行統計。結果 與正常組比較，模型組尿液代謝物變化顯著，氨基酸代謝相關物質降低，三羧酸循環、糖類代謝、脂肪酸代謝相關物質增高；與模型組比較，各針刺組三羧酸循環、脂質代謝相關物質降低（P<0.05）；熱補針法組三羧酸循環相關物質明顯低于平補平瀉組和捻轉補法組（P<0.05）。結論 熱補針法治療RA的特異性體現在對三羧酸循環的調控。

關鍵詞：熱補針法；風濕性關節炎；代謝組學；系統生物學；氣相色譜-四級桿飛行時間質譜；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.016

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）12-0064-05

Study on Intervention of Heat-reinforcing Needling for Metabonomics of Rabbits Urine with Rheumatoid Arthritis Cold Syndrome YUAN Bo1， WANG Jin-hai2， ZHANG Xing-hua1， TIAN Liang1， REN Chao-zhan3， DU Xiao-zheng1 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. The Second Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730030， China； 3. Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China）

Abstract： Objective To analyze the endogenous metabolites in urine of rabbits with rheumatoid arthritis （RA） cold syndrome； To investigate the specificity mechanisms of heat-reinforcing needling for RA. Methods Egg albumin inducing method combined with low temperature and freezing method was used to establish RA cold syndrome rabbit models. A total of 40 healthy purple blue rabbits were randomly divided into normal control group （NC）， model control （MC）， reinforcing-reducing needling group （RRN）， twirling-reinforcing needling group （TRN） and heat-reinforcing needling group （HRN） （n=8/group）. Except NC and MC， RRN was given acupuncture of reinforcing-reducing needling at Zusanli （ST36）， TRN was given acupuncture of twirling-reinforcing needling at Zusanli， and HRN was administrated acupuncture of heat-reinforcing needling at Zusanli， once a day and retaining 30 min， a total of seven days. Fresh urine sample after the intervention was collected and then gas chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry technology were used to evaluate metabolic profiles. All the data were analyzed by principal component analysis and partial least squares discriminant analysis. Results Compared with NC， the urine metabolites of MC changed significantly， mainly reflecting in the increase of amino acid metabolism were decreased， metabolites of TCA cycle， carbohydrate and fatty acid metabolism were increased； Compared with MC， the urine metabolites of TCA cycle and fatty acid metabolism were decreased in all intervention of acupuncture group （P<0.05）， but the metabolites of TCA cycle in HRN were obviously less than that of RRN and TRN （P<0.05）. Conclusion The specificity of heat-reinforcing needling for RA manifests in regulation of TCA cycle.

Key words： heat-reinforcing needling； rheumatoid arthritis； metabonomics； systems biology； GC-Q/TOF-MS； rabbits

基金項目：國家自然科學基金（81260558）；甘肅省自然科學基金（1208RJZA185）；甘肅省高校基本科研業務費項目（2011年）

通訊作者：杜小正，E-mail：lz-duxiaozheng@163.com

風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病。目前尚無根治方法，針灸具有抗炎、免疫調節等作用[1-3]，對RA具有確切的臨床療效[4]。熱補針法是鄭魁山教授簡化燒山火手法和進火法而形成的一種復式手法，具有補益正氣、溫陽散寒功效。課題組前期研究表明，熱補針法在治療RA過程中具有相對特異性的效果[5-8]。但前期研究僅從鎮痛方面進行了初步分析，缺乏對針刺后機體產生的全部生物信息的綜合分析。

代謝組學是一種能夠反映生物系統中所有低分子量（<1000）代謝物質的定性和定量分析手段，通過考察生物體系終末代謝產物的變化，研究生物體系代謝途徑[9-10]。氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用技術是最早應用于代謝組學的色質聯用技術，除具有較高的分辨率和檢測靈敏度外，還具有用來參考比較的標準代謝物譜庫。因此，該研究手段的優勢與針灸作用特點甚相吻合。為了進一步探討熱補針法治療RA的特異性機制，本研究以RA模型家兔為載體，采用氣相色譜-四極桿飛行時間質譜（GC-Q/TOF-MS）從系統生物學角度探討熱補針法治療RA的特異性機制。

1 材料與方法

1.1 動物

2～3月齡清潔級健康青紫藍家兔40只，雌雄各半，體質量（2.5±0.5）kg，蘭州生物制品研究所，許可證號SCXK（甘）2012-0001。飼養于溫度（20±2）℃，相對濕度（50±10）%，每日光照時間12 h，自由進食飲水。

1.2 針具、主要試劑與儀器

針灸針（華成牌，蘇州東邦醫療器械有限公司）。卵蛋白干粉（批號A5253-250G）、弗氏完全佐劑（批號F5881），Sigma公司。甲醇、吡啶，國藥集團；尿素酶、甲氧胺鹽酸吡，Sigma公司。Agilent 7890A/5975C GC/MS系統、毛細管色譜柱（HP-5 ms Agilent），J&W; Scientific公司。

1.3 分組及造模

家兔適應性飼養7 d，隨機分為正常組、模型組、平補平瀉組、捻轉補法組、熱補針法組，每組8只。采用卵蛋白誘導聯合低溫冷凍進行RA寒證模型復制[11-12]。實驗正式開始前3 d，用電推剃去家兔背部肩胛骨間的毛。將4 mg/mL卵蛋白溶液與等量弗氏完全佐劑混勻，充分震蕩成乳化劑，2%碘酒、75%乙醇消毒肩背部均勻選定的6個點，每點皮下注射0.2 mL。14 d后以相同方式、相同劑量重復皮下注射1次。第2次免疫后6 d，剃去家兔雙后腿膝關節周圍的毛，2%碘酒、75%乙醇消毒雙膝關節，關節內注入20 mg/mL卵蛋白生理鹽水溶液0.4 mL。24 h內膝關節出現紅腫觸痛，表明模型復制成功。成模后第2日，乙醇消毒兩后腿足，上、下、左、右圍置冰袋（3份冰+1份結晶氯化鈣，粉碎混合，溫度降至-20～-25 ℃冷凍1.5 h，45 ℃溫水復溫5 min（室溫12 ℃），共冷凍1次。冷凍后14 d，家兔表現為精神萎糜不振，兩后肢匍伏跛行，膝關節腫脹、周徑明顯大于對照組，局部青紫、皮溫不高，表示成功建立RA寒證模型。

1.4 針刺方法

先將家兔固定，選取后腿“足三里”[13]。各針刺組分別施以相應針法。熱補針法操作參照《鄭氏針灸全集》[14]：左手拇指緊按穴位，右手持針刺入穴內8～12 mm，針刺得氣后，左手加重壓力，右手拇指向前連續捻按5次；針下沉緊后針尖拉著有感應的部位，連續重插輕提5次；拇指再向前連續捻按5次，反復操作1 min；最后使針下沉緊，留針30 min。平補平瀉法、捻轉補法操作參照《刺法灸法學》[15]。平補平瀉法：針刺得氣后，前后均勻捻轉，不單向捻轉，指力均勻，角度180?～360?，頻率60～90 r/min，反復操作1 min。捻轉補法：針刺得氣后，小幅度前后捻轉針體（角度180?～360?，頻率60～90 r/min），拇指向前左轉時用力重、指力沉重向下，拇指向后右轉還原時用力輕，反復操作1 min。每日1次，每次留針30 min，連續7 d。

1.5 樣本采集

針刺結束后，收集各組新鮮尿液，8000 r/min離心10 min，用EP管收集上層尿液，離心分裝后置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.6 樣品衍生化處理

尿液常溫解凍后，混勻，取200 μL，12 000 r/min離心10 min，取上清液50 μL，加尿素酶10 μL，混勻，37 ℃反應15 min；加200 μL甲醇，轉入進樣瓶，置溫和氮氣下吹干；加入30 μL甲氧胺鹽酸吡啶 （20 mg/mL）溶液，強烈震蕩30 s，37 ℃反應90 min；取出，加入30 μL BSTFA（含1%TMCS，BSTFA∶TMCS=99∶1）的衍生試劑，70 ℃反應60 min。取出樣本，室溫放置30 min備檢。

1.7 氣相色譜-質譜條件

進樣口溫度280 ℃，EI離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，高純氦氣（純度>99.999%）作為載氣，不分流進樣，進樣量1.0 μL。升溫程序為：初始溫度80 ℃，維持2 min，10 ℃/min速度升至320 ℃，維持6 min。采用全掃描模式進行質譜檢測，質譜檢測范圍為50～550 m/z。采用隨機順序進行連續樣本分析，避免儀器信號波動所造成的影響。

1.8 統計學方法

原始數據采用XCMS軟件進行特征離子峰提取、峰對齊、色譜峰識別及峰匹配，然后構建多維數據集，采用SIMCA-P13.0進行多維數據分析，數據預處理采用Par的方式，數據分析方法包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），最后獲得差異物質。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原始色譜圖的可視化檢查

對所有樣本的總離子流色譜圖（TIC）進行重疊與匹配分析（見圖1），結果表明，質譜峰形明顯、界限清晰、重現性好，與標準品譜峰一致，5組樣品質譜峰重疊性良好。

2.2 模式識別

各組PCA圖見圖2。為了最大化反映各組別間代謝模式的差異，采用監督性PLS-DA，見圖3。從圖3中可以看出各組明顯區別，針刺干預后向正常組回歸，并且熱補針法組更突出。據PLS-DA模型第一主成分VIP值（閾值>1）并同時結合P值（P<0.05）來尋找差異性表達代謝物。通過以上分析，最終獲得的生物標記物見表1。可以得出，模型組尿液代謝物變化較正常組主要體現為氨基酸代謝相關物質降低，三羧酸循環、糖類代謝、脂肪酸代謝增強。各針刺組較模型組主要體現為三羧酸循環代謝及脂肪酸代謝降低，且熱補針法組三羧酸循環明顯于低平補平瀉組和捻轉補法組。

3 討論

RA屬中醫學“痹證”范疇。正氣虛弱是RA發病的內因，風寒濕邪侵犯是外因，邪氣乘虛侵入四肢關節筋骨，陽氣虛不能驅邪外出，邪氣黏滯纏綿，閉阻經絡，發為此病。熱補針法是鄭魁山教授臨床治療RA的經驗結晶，具有補益正氣、溫陽散寒的功用，與RA的病機特點相吻合。現代醫學研究發現，RA的發生與三羧酸循環、氨基酸代謝、脂肪酸代謝、葡萄糖代謝等密切相關[16-19]，其涉及的相關代謝物有檸檬酸、琥珀酸、肉堿、亮氨酸、麥芽糖、乳糖、嘧啶核苷酸、尿酸等。說明RA的發病機制具有途徑廣、層次多等復雜的網絡系統特點。因此，從現代醫學角度而言，其發病機制與針灸多靶點、多途徑、多層次、類似于網絡結構的作用特點相符。

本研究發現，模型組中琥珀酸、檸檬酸、異檸檬酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸、丙酮酸的量異常升高，以上這些物質均是三羧酸循環的中間產物。三羧酸循環反應在線粒體內發生，線粒體是細胞內氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要場所，它為細胞的活動提供了能量，這些代謝物的排泄增加可能會引發能量的供應不足。有研究顯示，RA關節腔缺氧[20]，細胞適應缺氧主要是從氧化磷酸化向糖酵解途徑轉換以產生ATP，模型組中乳糖參與糖代謝，是機體內的能量物質，其生成的半乳糖磷酸酯可以為糖酵解途徑提供能量，尿液中乳糖排泄量的異常說明RA體內糖酵解途徑發生改變而導致能量代謝通路出現紊亂。因此，我們的研究證實了這一結論。模型組中L-亮氨酸水平下降，它屬于支鏈亮氨酸，對于促進肌肉蛋白質的合成、骨豁肌微細損傷的修復、糖異生以及骨豁肌葡萄糖的攝取都起著重要的作用[21]；模型組參與多不飽和脂肪酸代謝的2-羥基十六烷酸、前列腺素E2甲酯、癸二酸、壬二酸的水平異常增高，以上這些物質可促使炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6的產生，TNF-α是RA發病機制中關鍵的促炎因子，可刺激軟骨細胞合成IL-6與IL-8，產生進一步的炎性反應，與IL-6、IL-1β等協同共同促進破骨細胞的生成導致骨質的破壞[22]，TNF-α又可增加一氧化氮、前列腺素E的生成和骨的吸收[23]。綜上所述，這些代謝途徑的改變可以解釋RA機體全身炎性反應狀態導致對能量的需求增加及供給的相對不足，經針刺干預后，參與脂肪酸代謝的上述代謝物均顯著降低（P<0.05），各針刺組之間比較差異無統計學意義（P>0.05）。針刺干預后參與三羧酸循環的上述物質普遍下調，尤以熱補針法組琥珀酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸下調最顯著（P<0.05），說明熱補針法可以調節RA異常的能量代謝通路。

平補平瀉法、捻轉補法及熱補針法均可使RA異常的三羧酸循環、脂肪酸代謝發生逆轉，提示這些針刺手法可調控RA體內三羧酸循環（能量代謝）、脂肪酸代謝（抗炎效應）通路，而熱補針法在調控三羧酸循環方面均明顯優于平補平瀉、捻轉補法。基于此，我們認為調控三羧酸循環（能量代謝）可能是熱補針法治療RA的特異性機制。

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（收稿日期：2016-01-23）

（修回日期：2016-02-20；編輯：華強）