金草片微生物限度檢查方法的適用性研究

于世海,胡佳,馬麗

1.遼寧康辰藥業有限公司,遼寧丹東 118300;2.錦州藥品檢驗檢測中心,遼寧錦州 121000;3.丹東宏業制藥有限公司,遼寧丹東 118300

金草片由筋骨草提取制成,具有清熱解毒,涼血消癥的功效,中醫辨證為瘀毒內結證,癥見:下腹脹痛或刺痛,腰骶疼痛,低熱起伏,神疲乏力,帶下量多,小便黃赤,大便干結,舌質紅或暗紅,邊尖瘀點或瘀斑,苔黃膩或白膩,脈弦滑或滑數。依據2015年《中國藥典》中規定[1],在檢查藥品內微生物限度時,僅在檢驗條件下,缺乏樣品濃度對污染微生物抑制生長時,才可真實反映出試品種微生物,進而確保檢驗結果的準確性和科學性[2]。針對存在抑菌作用的種類,需給予相應措施,如薄膜過濾法、離心沉淀法、培養基稀釋法,或任意兩種方式聯合使用,將抑菌作用消除后,再檢驗,進而確保方法可靠性[3-4]。

1 材料與設備

1.1 材料

金草片試驗菌:枯草芽孢桿菌(CMCC(B)63501)、黑曲霉(C M C C(F)9 8 0 0 3)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)、銅綠假單胞菌(CMCC(B)10104)、大腸埃希菌(CMCC(B)44102)、白色念珠菌(CMCC(F)98001),以上菌種均由中國食品藥品檢定研究院提供。

培養基:PH7.0氯化鈉-蛋白胨(批號:160801);胰酪大豆胨瓊脂(TSA)(批號:160819);胰酪大豆胨肉湯(TSB)(批號:160712);沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)(批號:160825);麥康凱肉湯(批號:160801);麥康凱瓊脂(批號:160303);以上培養基均由北京三藥科技開發有限公司提供。

1.2 儀器設備:

隔水式電熱恒溫培養箱: 303A-2型上海科學儀器有限公司

隔水式電熱恒溫培養箱:GHP-9160型上海一恒科學儀器有限公司;霉菌培養箱:MJ-150I型上海一恒科技有限公司;霉菌培養箱:MJ-150-I型上海一恒科學儀器有限公司;壓力蒸汽滅菌器:LDZX-30KBS型上海申安醫療器械廠;天平:HC-TP11B·5 型北京醫用天平廠。

2 方法

2.1 菌液制備

試驗菌株:檢查需氧菌總數所用菌株為枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、白色念珠菌。檢查霉菌和酵母菌的所用菌株為黑曲霉、白色念珠菌,控制菌檢查驗證菌株為乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌,試驗菌株傳代次數＜5代,并用菌種保藏方式保存,確保試驗菌株生物特性。

①檢查需氧菌總數,制備酵母菌和霉菌檢查方式驗證:分別接種枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌新鮮培養物至胰酪大豆胨液體10 mL培養基內,在30～35℃環境下培養18～24 h,取1 mL培養液加入到9 mL無菌氯化鈉溶液0.9%,用10倍遞增稀釋法將其稀釋到103～104cfu/mL,留置備用。

②將白色念珠菌新鮮培養到培養到沙氏葡萄糖液體培養基10 mL內,在23℃環境下培養24～48 h,取10 mL此培養液加入到加含0.05%(mL/mL)吐溫80的0.9%無菌NaCl溶液5 mL,洗下霉菌孢子,取出1mL霉菌孢子懸液加0.9%無菌NaCl溶液9mL,稀釋至霉菌數約為103～104cfu/mL。

③將黑曲霉新鮮培養物培養到沙氏葡萄糖瓊脂斜面,在23℃環境下培養7d左右,直至得到豐富孢子,將其加入5 mL含0.05%(mL/mL)吐溫80的0.9%無菌NaCl溶液洗下霉菌孢子,洗脫孢子,將其吸入到無菌試管內,取1 mL加入到聚山梨酯80 0.05%的9 mL無菌NaCl溶液0.9%中,用10倍遞增法進行稀釋處理,將其稀釋到10～5～10～7,制備為孢子菌懸液103～104cfu/mL,放置備用。

將所制備的菌液放置在室溫下,需在2 h內使用,保存在6℃環境下,可24 h內使用。將黑曲霉孢子懸液保存在6℃左右的環境下,此需在儲存期中使用。

驗證過程中,需逐一驗證各試驗菌回收率。驗證需氧均總數用常規傾注平皿法,霉菌和酵母菌檢查方法用常規傾注平皿法進行測定。

2.2 供試液制備

稱取供試品約為10 g,加入100 mL pH7.0無菌NaCl-蛋白胨緩沖液,制成稀釋比為1:10的供試液。取1:10供試液作為需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數、控制菌試驗檢查的供試液,備用。

2.3 計數方法適用性試驗

2.3.1 試驗組 ①需氧菌總數計數:取1:10供試液9.9 mL5份,分別加入5種試驗菌0.1 mL(約含104 cfu/mL),混勻。分別吸取1 mL注入平皿,傾注胰酪大豆瓊脂培養基,按常規平皿法測定需氧菌的菌落數。②霉菌和酵母菌總數計數:取1:10供試液9.9 mL2份,分別加入2種試驗菌0.1 mL(約含104 cfu/mL),混勻。分別吸取1 mL注入平皿,傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基,按常規平皿法測定霉菌和酵母菌的菌落數。

2.3.2 菌液組 以稀釋液替代供試液。取稀釋液9.9 mL,每份加入與試驗組相同的試驗菌0.1 mL(約含104cfu/mL),混勻。分別取1 mL注入平皿,傾注瓊脂培養基,按平皿法測定菌落數。

2.3.3 供試品對照組 取供試液,以稀釋液代替菌液同試驗組操作。

2.3.4 微生物的回收率 回收率=[(試驗組的平均菌落數-供試品對照組的平均菌落數)÷菌液組的菌落數]×100%

2.4 控制菌檢查方法

①大腸埃希菌取1:10供試液10 mL,加入到100 mL胰酪大豆液體培養基中,再向其中加入小于100 cfu的試驗菌,依《中國藥典》2015版相應控制菌檢查法進行檢查。

②控制菌采用常規法進行大腸埃希菌的檢測,大腸埃希菌陽性對照菌檢出。

3 結果

根據方法適用性試驗結果確定,金草片微生物限度檢查法如下:

3.1 需氧菌總數計數、霉菌和酵母菌總數計數

在3次平行試驗中(確保獨立),人為的污染金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉、白色念珠菌的試驗組的菌回收率均在0.5～2.0范圍內。最終確定取1:10的供試品溶液,采用傾注平皿法。

3.2 控制菌:

3.2.1 大腸埃希菌:采用常規法檢驗。即取1:10供試液10 mL,加入至100 mL胰酪大豆液體培養基培養基中,培養。

4 討論

因中成藥成分具有多種性,任何成分均具備抑菌功效,均可能對微生物限度檢查準確性造成影響,常規方式可用在抑菌作用弱或無抑菌功效的藥物,而較強抑菌作用的藥物,可用培養基稀釋法降低藥品內抑菌成分指數,進而消除對酵母菌、霉菌、細菌的生長影響。所以,在檢查藥品微生物限度前,需將自身抑菌干擾性排除,確保所測結果的有效性和可靠性[5]。中成藥金草片由筋骨草提取制成,雖然明顯抑制菌類生長[6],但是常規檢驗量1mL對微生物限度檢驗沒有抑菌作用,故采用常規傾注法。所以,在檢查中成藥微生物限度之前,需進行必要的成分分析,存在相應參考價值。綜上,中成藥金草片可采用微生物限度方式進行檢驗,可應用性極大,值得推廣。

[1]國家藥典委員會.《中國藥典》2015年版四部[M].中國醫藥科技出版社

[2]張萍,劉艷玲.小柴胡顆粒微生物限度檢查方法學研究[J].內蒙古中醫藥,2014,33(13):98-99.

[3]趙會蘭.20種中成藥微生物限度檢查方法驗證[J].中國執業藥師,2014(2):21-24.

[4]張美麗,楊曉東,鄧媛等.中成藥微生物限度檢查方法驗證[J].河南中醫,2014,34(3):532-534.

[5]張裕民,張純溪.不同廠家生產的消炎片微生物限度檢查結果分析[J].中國藥事,2016,30(5):477-481.

[6]趙會蘭.15種中成藥微生物限度檢查方法驗證[J].中國執業藥師,2014(5):17-20.