應用高效液相色譜—二極管陣列檢測器優化棉花體內多胺的測定方法

張一名??+劉玲玲+謝韞澤??+孫艷香+馮雪??賈永紅

摘要：應用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（HPLC-DAD）對棉花體內多胺測定時的流動相比例及流速、多胺全光譜信息等進行分析，重點比較2種常用檢測波長230、254 nm下的測定參數。最終確定檢測波長為230 nm、流動相體積比V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20、流速為0.6 mL/min為最佳色譜條件。該方法有較好的準確度、靈敏度，腐胺、亞精胺、精胺的回收率分別為98.58%、96.98%、99.62%，且非常穩定。以此色譜條件為基礎測定棉花幼苗不同組織中多胺水平發現，葉片中3種多胺的含量明顯高于根、莖組織；此外，不同組織內亞精胺含量最高。

關鍵詞：棉花；幼苗組織；多胺含量；高效液相色譜；二極管陣列檢測器

中圖分類號： S562.01文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0328-04

多胺（polyamines，PAs）是一類含有多個氨基的長鏈脂肪族化合物，廣泛存在于生物體內。在植物代謝途徑中，目前比較清楚的多胺形式主要有腐胺（putrescine，Put）、亞精胺（spermidine，Spd）、精胺（spermine，Spm）[1-2]。研究表明，多胺在植物體內是一類重要的生長調節因子，參與植物的細胞分裂[3-4]、性別分化[5]、果實成熟與衰老[6]、逆境適應[7-10]等重要生理過程。在分子水平的研究中還發現，多胺參與DNA的復制、轉錄、膜穩定、RNA和蛋白質的翻譯[11]、DNA凝聚及激素的調控[12]等過程。另外，在人體中也存在大量多胺類物質，并與人類健康息息相關[13]。由于植物性食物是人體內多胺的重要來源之一[14]，因此，如何準確而快速地檢測植物組織中的多胺技術越來越受到人們的重視。

多胺的測定以前主要用氨基酸分析儀、紙電泳等方法[15-16]，這2種檢測方法樣品回收率低，檢測靈敏度也不高。目前多用衍生化的方法，即將多胺的一、二級氨基接在鹵素原子上，另外還有接在熒光基團或對紫外有吸收的基團上，再通過氣相（GC）或液相（HPLC）方法進行分離檢測。其中，氣相色譜剛剛應用在植物多胺的研究方向，雖然分析時間短，但是對試樣要求高，前處理過程比較復雜[17]，并且應用質譜檢測設備價格昂貴，且分離檢測效果沒有顯著提高。自從1979年Redmond等采用苯甲?；姆椒ㄒ詠?，隨著不斷改進，高效液相色譜法已經成為較為成熟的檢測植物體內多胺的方法[18-21]。目前主要應用熒光檢測器（FLD）、紫外吸收檢測器（UV）。其中，FLD法檢測多胺的主要優勢在于靈敏度高[22]，但要用到有毒流動相乙腈。另外，由于瑞利散射、拉曼散射的干擾，使熒光檢測方法的條件構建和優化過程較為復雜，沒有一定的專業基礎較難完成。而紫外吸收法雖然靈敏度并不突出，但是可以用于植物體內多胺含量的測定，加上流動相中的甲醇毒性較低、儀器成本較低等優點，使得紫外吸收法成為當今國內用于測定植物多胺最常用的一種方法。

目前對于紫外吸收法檢測波長的選擇主要是苯甲酰氨基特征峰230 nm處、苯基特征峰254 nm處[15-16，18，23]。以上2種選擇對于多胺的檢測雖然都有一定的根據，但是對于檢測效果尚缺乏科學的比較。本研究應用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）廣譜記錄光譜信息，同時針對棉花幼苗組織樣本特點比較230、254 nm 2種檢測波長的操作性、可靠性，最終優化建立了可應用于UV檢測器的棉花幼苗組織樣本中3種多胺的檢測方法，并依據該方法比較棉花幼苗根、莖、葉組織內多胺含量的差異。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試棉花種子由廊坊師范學院生命科學學院遺傳與育種研究所提供，為農大棉7號。

1.2試驗方法

1.2.1棉花幼苗組織中多胺的提取取1.0～2.0 g棉花3葉期幼苗的不同新鮮組織，液氮研磨后加入4 mL預冷的5%高氯酸溶液，冰浴浸提1 h后離心（12 000 r/min，30 min，4 ℃）；取上清液為樣液，4 ℃保存備用。

1.2.2樣品的苯甲酰化取500 μL樣液，加入10 mL離心管中，先后加入14 μL苯甲酰氯、1 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，振蕩混勻后于37 ℃水浴反應20 min；加入2 mL飽和氯化鈉溶液，混勻后用2 mL乙醚萃取，離心（1 500 r/min，5 ℃，5 min）后取1 mL乙醚相真空干燥，用100 μL甲醇溶解后，用0.22 μm孔徑有機相濾膜過濾，即可進樣[21]。

1.2.3色譜條件的優化色譜儀：Agilent 1260 Infinity；色譜柱：[JP3]Agilent ZORBAX SB-C18 Stable Bond Analytical 4.6 mm×150 mm。

流動相與流速：綜合華永有等方法[22，24]，以甲醇、水混合物為流動相，測試甲醇體積分數為50%～90%時不同流動相的色譜性能，每變化10%進樣測定1次，確定最佳流動相比例。通過比較流動相流速為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL/min的檢測效果，確定最佳流速。

檢測波長：以二極管陣列檢測器收集190～900 nm區間內的吸光度數據，重點比較多胺在230、254 nm下標準曲線質量、回收率、標準偏差（RSD，%）、峰型，再結合3種多胺的光譜信息確定適合的檢測波長。

柱溫：30 ℃[21]。

時間：不限制。根據分析中雜質的具體洗脫情況，設定合理的分析時間。

1.2.4標準曲線的制作精確配制0.2 μmol/mL多胺標準溶液，苯甲酰化衍生后，將標準液稀釋為0.3、0.6、1.2、2.5、5.0、7.5、10.0 nmol/mL，取10 μL進樣；用安捷倫化學工作站（Agilent ChemStation）對230、254 nm信號數據進行分析，分別建立校正曲線。

1.2.5棉花葉片多胺回收率的測定取棉花葉片，抽提得到測定樣液，苯甲?；苌笕?0 μL進樣測定，在230、254 nm 2個檢測波長和標準曲線下各自得到樣品中3種多胺的含量數據。再分別將3種不同濃度苯甲?；蟮亩喟窐藴蕵悠芳尤氲揭阎獫舛鹊臉悠范喟诽崛∫褐?，并測定回收值[23]。根據樣品含量、加標量和所測得回收值分別計算回收率及其標準偏差。

1.2.6棉花幼苗不同組織中多胺含量測定按照“1.2.1”“1.2.2”節中的相應方法得到棉花幼苗根、莖、葉組織樣液，并進行衍生化。按照試驗最終確定的檢測條件，對棉花幼苗不同組織內的3種多胺含量進行檢測，重復3次。

2結果與分析

2.1流動相條件的優化

通過比較不同比例的流動相以及不同流速下多胺的檢測效果，發現流動相體積比V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20、流速為 0.6 mL/min 時，多胺的分離度、信號峰型較好，且棉花葉片樣品中目標峰信號與其他雜峰無明顯疊加；在此條件下，Put、Spd、Spm的保留時間分別約為5.09、9.30、17.75 min；并且，檢測樣液中存在的殘留苯甲酰氯峰（7 min左右）對檢測整體無影響（圖1）。

2.2檢測波長的確定

2.2.12種檢測波長下標準曲線的建立與比較標準曲線的制作在流動相體積比V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20，流速為 0.6 mL/min，檢測波長分別為230、254 nm的色譜條件下進行。數據由安捷倫化學工作站（Agilent ChemStation）處理并分別建立校正表，回歸方程見表1。從試驗結果可知，230、254 nm檢測波長下多胺Put、Spd、Spm回歸方程的決定系數（r2）[CM（231]均大于[KG5]0.99，說明2種波長均能夠應用于棉花幼苗組織[CM）]

內多胺含量的測定；但是通過比較可以看出，波長為 230 nm 時回歸方程的r2均高于波長為254 nm下的r2。因此本研究表明，從標準曲線決定系數的角度考量，檢測波長為230 nm 要優于254 nm。

2.2.22種檢測波長下回收率標準偏差的測定由表2可以看出，在230 nm檢測波長下，Put、Spd、Spm的平均回收率均在95%以上，分別為98.58%、96.98%、99.62%，RSD分別為1.56%、0.78%、0.95%。當檢測波長為254 nm時，回收率均超過100.00%，且該檢測波長下RSD較高，分別為540%、9.49%、2.93%。說明當檢測波長為254 nm時，盡管有較高的回收率，但是檢測數據的穩定性下降，檢測誤差增大。因此，從回收率RSD的角度評價可知：230 nm較254 nm更適合作為檢測波長測定棉花樣品中的多胺含量。

2.2.32種檢測波長下的峰型比較如圖2所示，比較230、254 nm下棉花幼葉等量程色譜圖可以發現：檢測波長為 230 nm 時，3種多胺的響應值較大，雖然同時也增大了部分雜質及副反應的響應峰值，但是目標峰仍然明顯；254 nm作為檢測波長時，雖然雜質響應較小，但是3種多胺的信號響應值同樣較低。

2.2.43種多胺的吸收光譜信息用二極管陣列檢測器（DAD）分別收集3種多胺信號峰在波長190～900 nm的光譜信息。由圖3可見，3種多胺在200 nm處有最高吸收峰，230 nm 左右均有明顯的第2吸收峰。由于多種物質在 200 nm 處均存在光譜吸收峰，可使基線漂移嚴重，而在 230 nm 的第2吸收峰附近雜質相應明顯減少（圖4）。因此根據3種多胺各自的光譜信息分析可知：選擇檢測波長在230 nm左右的第2吸收峰要優于其他波長。

[CM（24]綜上所述，棉花幼苗組織內3種多胺含量的色譜檢測應[CM）]

2.3分析時間的確定

在棉花幼葉樣品的不限時檢測中，保留時間在30～32 min 仍有不規則雜峰（圖2、圖4），而32 min后信號基本回歸基線。因此，為洗脫雜質的同時保留完整數據，設定單針樣品的分析時間為35 min，且無后運行為宜。

2.4棉花幼苗不同組織的多胺含量比較

依據前期試驗結果得出：流動相體積比為V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20、流速為0.6 mL/min、檢測波長為230 nm為最適合的色譜條件。對棉花根、莖、葉組織進行3種多胺含量的測定，結果表明，多胺在棉花幼苗組織中含量普遍偏少，響應值較低，均在nmol/g水平。如表3所示，所測組織中Spd含量最高，在不同組織內的含量均高于Put、Spm含量；另外，棉花幼苗葉片組織中的3種多胺總含量為（41.90±1.56） nmol/g，遠遠高于根的（18.18±2.61） nmol/g、莖的（12.97±2.52） nmol/g。

3結論與討論

3.1色譜條件的優化

以往研究表明，多胺的次級胺基與柱子硅羥基的相互作用，可引起在不同的流動相條件下，保留時間會產生較大變化[23]。本研究選擇流動相體積比V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20，可以減少洗脫時間、降低分析時間。采用流速為0.6 mL/min，即可將樣品中各個組分比較清晰地分離開來。以上結果優化了之前報道的相關方法[15，22，24]，得出了專門針對棉花幼苗組織內多胺含量檢測的可靠色譜條件。

有報道顯示，衍生化過程中的苯甲酰氯殘留會對多胺色譜分析產生一定影響[24]。本試驗表明，Put、Spd、Spm的保留時間分別為5.09、9.61、17.75 min，苯甲酰氯的保留時間約為7.21 min，避免了苯甲酰氯、腐胺的峰重疊現象，并且3種多胺信號與組織樣品中其他雜峰信號互不干擾。

3.2檢測波長的比較

對于目前檢測多胺含量常用的2種檢測波長230、254 nm，筆者所在實驗室以二極管陣列檢測器收集190～900 nm 區間內吸光度數據發現：3種多胺檢測波長約為 230 nm 時，均為第2高吸收峰，且苯甲酰氨基的顯色受多胺脂肪鏈及其他副反應雜質的影響不大；而以254 nm作為檢測波長時，雖然雜質響應較小，但3種主要多胺的信號響應值同樣較小，使標準曲線的線性相關性等降低。因此，在多胺本底水平比較低的棉花幼苗上不適用254 nm波長，選擇 230 nm 波長為宜。

3.3優化的方法以及所得檢測結果分析

如前文所述，最終確定最佳色譜條件：檢測波長為 230 nm，流動相體積比為V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20，流速為 0.6 mL/min。

按照以上方法，棉花幼苗組織多胺含量檢測結果顯示，幼苗期棉花組織內Spd含量在3種多胺中最高。該結果可能表明，在植株的快速生長期，Spd起一些重要的作用[25-26]。在棉花組培苗組織內多胺的研究中，Spd在球形胚形成期含量顯著升高，明顯高于Put、Spm，報道中對這些現象的解釋是高水平Spd可能有助于細胞分化[27-28]，但是具體的代謝以及調控方式正在進一步研究中。

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[FK（H02642/3。54ZQ]

〖HTH〗更正：《江蘇農業科學》2016年第44卷第6期338-340頁所刊論文《不同組合尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚的繁育比較》，第一作者應該為黃培鈴，特此更正。