油茶籽油中角鯊烯的高效液相色譜分析

馬力??+陳永忠??+鐘海雁??+周波??+彭邵鋒??+李志鋼??+王湘南??+王保明??+彭映赫??+王瑞

摘要：建立了油茶籽油中角鯊烯的HPLC測定方法。樣品采用硅膠柱提純處理優(yōu)于皂化處理、皂化處理后硅膠柱提純處理，得到的色譜峰雜峰少、角鯊烯峰型對稱、峰面積較大。最佳色譜條件為C18柱，流動相V乙腈 ∶[KG-3]V甲醇為 40 ∶[KG-3]60，檢測波長210 nm，流速為1 mL/min，柱溫為40 ℃。該方法下角鯊烯在0.01～0.4 mg/mL 范圍內(nèi)濃度和面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 6；平均回收率100.28%（RSD=1.9）；精密度RSD（n=6）為1.24%；可用于實驗室檢測油茶籽油中角鯊烯的含量。

關(guān)鍵詞：油茶籽油；角鯊烯；高效液相色譜；流動相；色譜條件

中圖分類號： O657.7文獻標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0353-04

油茶籽油含角鯊烯、維生素E等活性成分，賦予其與眾不同的營養(yǎng)保健作用。角鯊烯是具有促進血液循環(huán)、細(xì)胞修復(fù)、抗氧化和消炎殺菌等功能的天然活性成分[1-3]，廣泛用于醫(yī)療保健品和化妝品等方面。目前角鯊烯軟來源主要是深海魚類，植物性來源的角鯊烯較少。已知莧屬植物種子油中角鯊烯含量可達(dá)5%～8%，甘草根、帶皮種子和去皮種子中角鯊烯含量分別為0.2%、0.104 5%、0.078 1%，橄欖油、棕櫚油、玉米油和米糠油等也含一定量的角鯊烯。角鯊烯的檢測尚未有相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)或者規(guī)范性文件[4]，在現(xiàn)有的研究中大多采用薄層層析法（TCL）、氣相色譜法（GC）和液相色譜法（HPLC）[5]。但薄層層析法人工影響因素較多；氣相色譜法需要前期對檢測物進行衍生處理，易引入新的雜質(zhì)，費時費力。本試驗采用TCL定性測定油茶籽油中是否含有角鯊烯，采用waters C18反相極性色譜柱考察流動相及流動相比例、流速及柱溫對油茶籽油中角鯊烯分離效果的影響。

1材料與方法

1.1試驗材料、儀器與試劑

1.1.1試驗材料供試的油茶籽由湖南省林業(yè)科學(xué)院提供。

1.1.2試劑甲醇、乙腈和正己烷，均為色譜純；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸銀、石油醚、氫氧化鉀、硫酸鈉和角鯊烯，均為分析純；柱層層析硅膠，為試劑級。

1.1.3試驗儀器榨油機，湖南省林業(yè)科學(xué)院自制；DHG-9070A型電熱恒溫箱，北京佳源興業(yè)科技有限公司生產(chǎn)；SZF-06GI粗脂肪測定儀，上海新嘉電子有限公司生產(chǎn)；KQ-700DV數(shù)控超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；P10-Y實驗室超純水器（國之源）；LC-2010AHT液相色譜儀，日本島津公司生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1測定油樣的制取稱取1～1.5 kg油茶籽，置于干燥箱105 ℃干燥至恒質(zhì)量后，用壓榨機提油，將油靜置、除雜后，備用。

1.2.2角鯊烯測定條件優(yōu)化

1.2.2.1角鯊烯的定性分析用10 cm×20 cm硅膠 GF254薄層層析薄板鑒定油茶籽油中是否含有角鯊烯。

點樣：在距薄層層析板1側(cè)的底部1 cm處畫好1條直線作為起點線，用毛細(xì)管分別吸取標(biāo)準(zhǔn)角鯊烯溶液和油茶籽油樣品垂直輕輕地接觸到起點線上，樣點間距為1～1.5 cm。

顯色：將展開劑加入到層析缸中，將層析缸密封1 h，然后將薄層層析板放入進行展開，當(dāng)展開劑的前沿已到達(dá)薄層層析板上端0.5～1 cm時，迅速取出薄層層析板，晾干。將除去展開劑的層析板，碘缸顯色20～30 min，即出現(xiàn)黃色斑點，取出后計算Rf值。Rf值為斑點中心距原點的距離與溶劑展開前沿距原點距離的比值。

1.2.2.2角鯊烯預(yù)處理優(yōu)化

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取0.1 g的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL的容量瓶中，用正己烷定容至刻度并搖勻，配制成濃度為10 mg/mL的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

角鯊烯樣品預(yù)處理條件的優(yōu)化分3種不同的處理方法。

處理1（A）：皂化處理。稱取1 g油茶籽油于250 mL的磨口錐形瓶中，加入2 mol/L的KOH-乙醇溶液50 mL，連接好回流裝置，在85 ℃的恒溫水浴鍋中回流1 h，移出后冷卻至室溫。將皂化液轉(zhuǎn)入250 mL的分液漏斗中，加入飽和氯化鈉溶液50 mL，然后加入50 mL石油醚，充分振搖萃取，靜置分層后將上層溶液轉(zhuǎn)入250 mL的分液漏斗中，下層溶液再用50 mL 石油醚萃取2次，合并3次的上層有機相溶液，用去離子水洗至中性，然后過無水硫酸鈉脫水，在35 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用正己烷定容至2 mL，混勻后，過0.45 μm微孔濾膜于進樣瓶中，作為待測液。

處理2（B）：硅膠柱提純處理。采用濕法裝柱法，將硅膠柱固定于鐵架臺上，倒入約100 mL的石油醚，稱取10 g經(jīng)500 ℃烘干的硅膠，慢慢倒入硅膠柱中，靜置片刻，再加入 0.5 cm 無水硫酸鈉（約2 g），打開塞子，使石油醚緩慢淋洗下來，確保柱中硅膠填料均勻，不出現(xiàn)氣泡和斷層現(xiàn)象。稱取 1 g 左右的油茶籽油樣品放置于小燒杯中，用少量石油醚分?jǐn)?shù)次潤洗小燒杯，洗滌液一并倒入小柱中，加入50 mL石油醚于硅膠柱中，打開旋塞，收集濾液，當(dāng)石油醚液面與上端無水硫酸鈉層相切時，再分2次加入50 mL石油醚，收集全部的洗脫液至錐形瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液，然后用氮吹儀氮吹至干，隨后用正己烷定容至2 mL，充分振搖，過0.45 μm微孔濾膜，作為待測液轉(zhuǎn)移到進樣瓶中。

處理3（C）：皂化處理后硅膠柱提純處理。按處理1皂化萃取后，再按處理2硅膠柱提取。

1.2.2.3角鯊烯高效液相色譜測定的條件優(yōu)化

流動相選擇：在流速為1 mL/min和柱溫40 ℃的相同條件下，改變流動相，考察甲醇、乙腈、甲醇/乙腈（V/V，50/50）體系對分離效果的影響。

流動相比例的選擇：在流速為1 mL/min和柱溫40 ℃的相同條件下，選擇較優(yōu)的流動相比例，考察流動相比例對分離效果的影響。

柱溫的選擇：在乙腈/甲醇（V/V，40/60）作為流動相和流速為1 mL/min的相同條件下，改變柱溫（35、40、45 ℃），考察柱溫對分離效果的影響。

流速的選擇：在流速為1 mL/min和柱溫40 ℃的相同條件下，改變流速（0.8、1.0、1.2 mL/min），考察流速對分離效果的影響。

2結(jié)果與分析

2.1薄層層析法（TLC）定性檢測油茶籽油中的角鯊烯

由圖1可知，在Rf=0.662處有一個黃色斑點，斑點非常清晰，未產(chǎn)生拖尾，與角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品完全一致。說明油茶籽油中含有角鯊烯。

2.2預(yù)處理條件的測定結(jié)果

采用3種不同的預(yù)處理方法對油茶籽油樣品進行處理，處理后的色譜圖如圖2至圖4所示。

由圖2至圖4可知，油茶籽油經(jīng)不同的預(yù)處理方法得到的角鯊烯HPLC圖譜差異很大。經(jīng)皂化處理后的HPLC圖譜雜[CM（25]質(zhì)峰較多，目標(biāo)峰（角鯊烯）附近有干擾，損害色譜柱，且皂[CM）]

化時間過長。經(jīng)硅膠柱提純處理后的HPLC圖譜峰形較好，附近沒有雜質(zhì)峰的干擾，方法簡單且角鯊烯峰型對稱、峰面積較大。經(jīng)皂化處理和硅膠柱提純處理后的HPLC圖譜與硅膠柱提取后的HPLC圖譜處理的效果差別不大，但角鯊烯峰面積偏低，且操作過程較為繁瑣，因此硅膠柱提取法是一種較優(yōu)的預(yù)處理方法，最終能使角鯊烯得到良好的分離效果。

2.3角鯊烯檢測高效液相色譜法條件的研究

2.3.1流動相的選擇

由圖5可知，采用乙腈作為流動相，由于乙腈具有較強的洗脫能力，圖譜中僅有1個大峰，溶劑峰與目標(biāo)峰沒有分開。采用甲醇和甲醇/乙腈（V/V，50/50）分離效果均較好，因乙腈較甲醇使柱內(nèi)承受的壓力低，考慮到色譜柱的使用壽命，選用甲醇/乙腈作為流動相。

2.3.2流動相比例的選擇由圖6可知，樣品在不同比例的流動相條件下都能與雜質(zhì)峰分開，但是隨著乙腈比例的增加，樣品的保留時間增加，當(dāng)乙腈增加到60%時，樣品主峰的保留時間為29 min。一般情況下，因乙腈的洗脫能力較甲醇強，增加乙腈的比例，樣品的保留時間縮短，但在本試驗中，隨著乙腈的比例增加，樣品的保留時間反而延長，這可能與角鯊烯的特有性質(zhì)有關(guān)。為縮短樣品的保留時間，選擇乙腈/甲醇（V/V，40/60）作為流動相。

2.3.3柱溫的選擇

柱溫是最重要的色譜操作條件，它直接影響色譜柱的選擇性、色譜峰區(qū)域展寬和分析速度[6]。由圖7可知，在柱溫為35、40、45 ℃時，峰形有一定的變化，但在試驗中觀察到峰面積變化很小；樣品主峰跟其他雜質(zhì)峰均分離良好，樣品的保留時間隨著柱溫的升高都前移了。因柱溫太高容易損傷色譜柱，綜合考慮樣品的保留時間和柱子的使用壽命，柱溫選擇40 ℃。

2.3.4流速的選擇

由圖8可知，在流速選擇0.8、1.0、1.2 mL/min 時，樣品主峰跟其他雜質(zhì)峰均分離良好，流速增大時，峰寬變小，但峰面積變化不大。樣品的保留時間隨著流速的增大而縮短。同時，隨著流速的增大，柱壓會上升。綜合

考慮分析時間及柱子使用壽命，流速選擇1.0 mL/min。

2.4高效液相色譜法檢測角鯊烯的效果評價

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)角鯊烯濃度與峰面積的線性關(guān)系

量取一定量10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用正己烷稀釋，配制成濃度分別為001、0.05、0.10、0.15、0.20、0.40 mg/mL的標(biāo)樣，按選定的色譜條件，取10 μL進樣，記錄色譜圖，測定其峰面積，以峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）進行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（圖9）及線性回歸方程。

線性回歸方程y=4×107x+198 720，r2=0999 6，線性范圍0.01～0.4 mg/mL。

2.4.2穩(wěn)定性試驗

精確稱取油茶籽油樣品1 g，經(jīng)硅膠柱提取處理后用正己烷定容至2 mL，每隔8 h進樣10 μL，按照優(yōu)化的色譜條件進行定量分析。穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表1。根據(jù)表1，計算出RSD為1.26%，說明用本試驗方法制成的供試樣品溶液中的角鯊烯在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3回收率試驗

加標(biāo)回收率是表示準(zhǔn)確度的一個指標(biāo)。稱取已知角鯊烯含量（80.02 μg/g）的油茶籽油樣品，再添加5 μL 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品溶液。經(jīng)硅膠柱提取處理后用正己烷定容至2 mL，進樣10 μL，按照優(yōu)化的色譜條件進行定量分析，重復(fù)3次，回收率試驗結(jié)果見表2。

根據(jù)表2，得到該試驗方法的平均回收率為100.28%，RSD為1.9%，說明該方法的回收率良好，即測定方法有良好的準(zhǔn)確度，是可靠的。

2.4.4精密度的測定

柱溫為40 ℃。該方法下角鯊烯在0.01～0.40 mg/mL范圍內(nèi)濃度和面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 6，平均回收率100.28%（RSD=19%），精密度RSD（n=6）為124%。該方法可用于實驗室檢測油茶籽油中角鯊烯的含量。

液相色譜法[7-8]已應(yīng)用于甘草[9-10]、羅漢果[11]中角鯊烯含量的測定，但應(yīng)用于油茶籽油的檢測中尚未有報道。本研究建立了油茶籽油中角鯊烯的HPLC測定方法，對建立油茶籽油中角鯊烯含量測定的標(biāo)準(zhǔn)方法具有參考價值。

參考文獻：

[1]鐘冬蓮，湯富彬，沈丹玉，等. 油茶籽油中角鯊烯含量的氣相色譜法測定[J]. 分析試驗室，2011，30（1）：104-106.

[2]王海洪，黃曉春. 用深海鯊魚制備角鯊烯、角鯊?fù)閇J]. 東海海洋，1999，17（2）：43-46.

[3]陳思偉，陳上云. 角鯊烯對部分T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報，1997，13（2）：131-132.

[4]陳偉珠，方華，張怡評，等. 超高效液相色譜法檢測角鯊烯[J]. 食品與發(fā)酵科技，2014，50（6）：74-76，86.

[5]梁新華，鄭彩霞，張風(fēng)俠，等. 甘草角鯊烯的提取及高效液相色譜分析[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，32（2）：123-126.

[6]趙軼男. 高效液相色譜技術(shù)（HPLC）影響因素的選擇[J]. 分析實驗室，2007，26：340-341.

[7]李青，譚紅，袁鑫，等. 高效液相色譜法測定核桃青皮中胡桃醌的含量[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：259-261.

[8]李智寧，李湄川，胡德禹，等. 高效液相色譜法測定煙草上的噻森銅[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：284-286.

[9]汪運明，陳華勇，楊繼國，等. 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定茶油中角鯊烯含量[J]. 食品工業(yè)科技，2011（6）：404-406.[ZK）]

[10]梁新華，鄭彩霞，張風(fēng)俠，等. 甘草角鯊烯的提取及高效液相色譜分析[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，32（2）：123-126.

[11]陳全斌，程忠泉，楊建香，等. 羅漢果種仁油中角鯊烯的高效液相色譜分析[J]. 廣西科學(xué)，2006，13（2）：118-120.