嚙齒類海馬神經元的原代培養及方法改進

陳學周++畢意輝++張可可++張明凱++尤濤

摘 要：目的：通過對新生嚙齒類海馬神經元的分離和培養，嘗試建立一個簡單、穩定、高效的嚙齒類海馬神經元原代培養方法，為脊髓損傷的相關分子機制研究提供目的細胞。方法：取新生SD乳鼠的海馬組織，通過低濃度胰酶消化制成細胞懸液、4h差速貼壁后使用無血清Neurobasal培養基培養，倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態，免疫熒光對海馬神經元相關微管蛋白-2（MAP2）行特異性染色，結合DAPI核染色鑒定神經元。結果：該方法培養的海馬神經元生長狀態良好，純度較高。結論：采用低濃度胰酶消化，差速貼壁及無血清培養嚙齒類海馬神經元符合體外細胞實驗要求，為進一步研究提供良好的目的細胞。

關鍵詞：海馬神經元；低濃度胰酶；差速貼壁；無血清培養

中圖分類號 Q42 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）02-06-03

Culturing and Identification of the Neonatal Rodent Hippocampal Neurons

Chen Xuezhou1 et al.

（1 The Department of Orthopedics， the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Hefei 230022，China）

Abstract：Obejctive：To established a simple， effective and stable method for the culture of rat hippocampal neurons in vitro， and provide target cell for dissecting molecular and cellular mechanisms in neuroscience.Methods：The hippocampus of neonatal rat were dissected and cell suspension were digested by low concentration of trypsin.The cell suspensions were cultured with serum-free Neurobasal medium after four hours differential adherence.Morphological observation of neurons growth state by inverted microscope， the hippocampal neurons can be identified by MAP2 specific antibody with DAPI.Results：The hippocampal neurons grew well and reached a high purity.Conclusion：Using low concentration of trypsin， differantial adherence and serum-free medium conforms to the requirements of neonatal rat hippocampal neurons culture in vitro， so as to provide targeted cells for further research.

Key words：Hippocampal neurons；Low concentration of trypsin；Differantial adherence；Serum-free medium

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱外科一種致殘率很高的疾病，易造成患者運動功能障礙，大小便失禁甚至終身癱瘓[1]。現代研究表明，脊髓損傷后，經歷第一次原發性損傷及第二次繼發性損傷，二次損傷是繼發性，是可以預防和治療的，其重點在于保護殘存神經元的功能[2]。建立簡單、穩定、高效的神經元體外培養是在細胞水平研究脊髓損傷的重要物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 出生24h內SD乳鼠，雌雄不限，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 Neurobasal培養基、B27無血清添加劑、GlutaMAX-I添加劑、DMEM（high glucose）培養基、滅活胎牛血清、0.25%胰酶、臺盼藍染液均購自Invitrogen公司，多聚-D-賴氨酸、DPBS、Hanks液、抗熒光淬變封片液購自碧云天公司，DNase I、DAPI、Triton X-100購自sigma公司，神經元相關微管蛋白-2（MAP2）、Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（H+L）購自abcam公司。

1.1.3 主要器材 24孔細胞培養板、15mm細胞爬片、超凈工作臺、細胞培養箱、激光共聚焦顯微鏡、手術解剖顯微鏡

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 種植培養液：含90%DMEM+10%滅活胎牛血清。維持培養液：98%Neurobasal培養基+2%B27無血清添加劑+0.5mMGlutaMAX-I添加劑。

1.2.2 細胞爬片及細胞培養孔板處理 將滅菌的15mm細胞爬片用DPBS配制的0.1mg/mL多聚-D-賴氨酸溶液浸泡，室溫孵育2h，吸棄多聚-D-賴氨酸溶液，蒸餾水洗2遍，晾干待用。

1.2.3 海馬神經元的分離 取出生24h內SD乳鼠，75%酒精消毒后斷頭，依次剪開皮膚、顱骨，迅速取出腦組織置于冰上含有預冷Hanks液的培養皿中。在手術顯微鏡下分離出兩側的海馬區，徹底剝離腦膜及血管。用剪刀剪成約1mm3大小，加入預熱的0.05%胰酶，放入37℃消化15min（每7min稍微搖晃一下）。小心吸走消化過組織，用2mL含10%胎牛血清的DMEM培養基終止消化，加入100μLDNase I，混勻后使用1mL槍頭上下輕柔吹打15下，靜置2min，吸取上清液。再像沉淀的組織團塊中加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養基及100μL DNase I，重復上述吹打步驟。吸取上層細胞懸液，如此重復2次。70μm細胞篩過濾，1000r/min離心5min棄上清，使用種植培養基重懸，吸100μL細胞懸液后加入100μL臺盼藍染液，于血球計數器下計數細胞，調整細胞密度至2×105個/mL，每孔加入1mL，十字搖板數次，放入培養箱內。以上操作確保在2h內全部完成。4h后使用無血清DMEM培養基洗板鏡檢細胞碎片基本去除后，換成Neurobasal培養基，后每2d半量換液。

1.2.4 神經元細胞鑒定 取體外培養7d的海馬神經元細胞爬片，吸出培養基，PBS洗1次，加入1mL預熱多聚甲醛溶液，確保神經突不被破壞，室溫孵育10min。PBS洗1次，0.1%Triton X-100通透膜10min。加入10%山羊血清孵育1h后，加入1%血清稀釋的MAP2（1∶500），4℃濕盒孵育過夜。加入1%血清稀釋的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶1 000），室溫避光孵育1h。DAPI復染5min后，將細胞爬片反轉放至滴有抗熒光淬滅封固液的干凈載玻片上。避光干燥后使用透明指甲油密封載玻片邊緣，激光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 細胞形態的觀察 剛接種細胞分散，呈圓形透亮。4h后細胞已貼壁，部分細胞已伸出短小軸突。1～2d后，細胞明顯增大，突起延伸，形成稀疏網絡。在培養過程中，神經元之間的纖維聯系逐漸豐富，并形成網絡。5～7d神經元在倒置顯微鏡下可見具有明顯的光暈，此時神經元胞體呈三角形、橢圓形或多邊形，邊界清楚，胞體明亮，立體感增強（圖1、圖2）。

3 討論與結論

神經元是腦及脊髓組織中最基本的組成成分，對神經系統功能的發揮著主要的作用，是腦及脊髓損傷中最常用的細胞，其培養和鑒定技術亦是神經生物學研究中最基本的技術。但是連續的神經元細胞系因無法形成典型的軸突、樹突及突觸而得不到廣泛應用，而原代培養的神經元比傳代細胞系更加接近在體狀態，是研究工作中較佳的目的細胞，得到了廣泛應用。

理論上，原代神經元的培養可通過大腦任何部位及脊髓獲取，但海馬部位較其他部位神經細胞成分簡單，含量多，擁有典型的細胞表型[3-4]。傳統方法多采用胎鼠進行海馬神經元的培養[5-6]，其神經分化程度低，便于培養，但由于操作復雜，如進行雌雄鼠配種，計算胎齡，實驗時間不可控制，取材時胎鼠表面羊水過多，海馬較小等導致操作要求高。而采用乳鼠較胎鼠具有較多的優點，可按照實驗按需處死一至數只實驗乳鼠，取材較胎鼠簡單，無需擔心缺氧對胎鼠腦神經元的損害。

在海馬神經元培養的過程中，很多因素都會影響原代海馬神經元培養的質量，如收集細胞過少，接種時死細胞比例過高，雜細胞過多等，其對實驗條件的要求較普通細胞更高。首先，除了消化以外，其他操作均在冰上操作，從解剖至接種細胞控制在2h內完成，盡量減少組織細胞代謝。解剖時，在手術顯微鏡下盡可能去除海馬組織表面所有的血管膜，以免消化后被迫吹打，導致接種時死細胞及雜細胞比例過高。其次，組織在消化前用剪刀剪碎，并使用低濃度0.05%胰酶加適量DNA酶，作用時間控制在15min左右，低濃度胰酶消化能力相對溫和，死細胞較少，從而避免使用木瓜酶現用現配的缺點。DNA酶可分解消化過程死細胞釋放出來的DNA，避免組織纏結，吹打過程可收獲更多單細胞懸液。吹打時，采用分步吹打，慢吸慢吹，動作輕柔，保證每一個單細胞都避免過度吹打，盡可能多地收集細胞。再次，使用含10%滅活胎牛血清重懸、接種細胞，其血清成分可促進細胞生長、增殖，4h后換成含B27添加劑的Neurobasal培養基，換液前輕微震蕩，可將多數貼壁不牢固的膠質細胞及細胞碎片去除。含B27添加劑的Neurobasal培養基其成分確定，培養出的細胞狀態均一，選擇性促進神經細胞生長，而膠質細胞幾乎不分裂。最后，接種板也是決定實驗成敗的關鍵因素，接種板密度過低，神經元突觸形成過少，無法利用自身分泌促生長因子，同時膠質細胞分裂過多，難以存活和成熟。密度過高，營養相互爭奪，細胞容易抱團生長，均會導致實驗失敗。本實驗膠質細胞含量較少，未使用阿糖胞苷抑制膠質細胞生長，因阿糖胞苷加入時間及劑量難以控制，毒性較大，除了抑制膠質細胞外，對正常海馬神經元亦有毒害作用。

綜上所述，采用低濃度胰酶消化，差速貼壁及無血清培養新生SD乳鼠海馬神經元的方法簡單、穩定、高效，可得到高密度的符合體外實驗要求的細胞，為神經系統損傷的研究提供了良好的目的細胞。

參考文獻

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（責編：張宏民）