一株海南野生靈芝的rDNA—ITS鑒定與系統發育分析

范平杰++姜芳燕++李珍++馬紅梅++陳永敢

摘 要：靈芝是一類重要的木腐真菌，在我國海南島有廣泛分布。研究擴增了1株分離自海南五指山的靈芝菌株rDNA-ITS序列，構建系統發育樹，并比較了其與部分親緣關系較近靈芝的rDNA-ITS序列差異。結果表明，分離自海南五指山的菌株Wzs1與G.resinaceum類群親緣關系較近，支持聚類的自展值為26%，表明靈芝Wzs1與G.resinaceum類群較相近。

關鍵詞：海南；靈芝；rDNA-ITS；系統發育

中圖分類號 Q933 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）02-14-03

靈芝（Ganoderma spp.）是一種重要的腐生型真菌，隸屬于真菌界（Kingdom Fungi），擔子菌門（Basidiomycota），擔子菌綱（Basidiomycetes），靈芝目（Ganodermatales），靈芝科（Ganodermataceae）[1]。野生靈芝的形態特征常常由于受到外部環境的影響產生很大的差異，有傘形、馬蹄形等，菌蓋有圓形、半圓形或腎形等，菌蓋表面一般有光澤或環形紋理。海南島的熱帶和亞熱帶雨林氣候為野生靈芝生長發育提供了適宜的溫度和濕度，豐富的原始森林為靈芝生長提供充足的營養成分。至今已發現野生靈芝科有103個種，分為4個屬，3個亞屬，其中海南有72個種，約占總數的70%，表明海南島是我國野生靈芝分布最豐富的地區之一[2]。本研究利用rDNA-ITS引物，擴增1株靈芝菌株的序列，并構建系統發育樹，研究菌株的分類學地位及親緣關系，以便今后進一步的資源探索和菌株進化研究提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試菌株分離、培養及DNA的提取 供試菌株Wzs1為靈芝子實體經酒精-次氯酸鈉-酒精常規表面消毒后，置放于PDA培養基表面，于25℃恒溫培養至長出菌落，純化后4℃冷藏保存。菌種斜面上挑取菌絲接種至30mLGY液體培養基中，25℃搖床培養14d，收集菌絲用于DNA提取[3]。

1.2 PCR擴增及產物的克隆和測序 擴增片段為ITS1、5.8S和ITS2區域，引物為ITS1 （5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4 （5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3） [3]。目的片段的擴增及克隆參照Chen等方法[4]，將含有目的基因片段的菌液委托北京華大基因科技股份有限公司測序。

1.3 系統發育學分析及DNA序列差異性比較 根據菌株的rDNA-ITS測序結果，在GenBank數據庫中進行Blast比對，搜索同源序列。選取不同種的代表性菌株作進一步的分析。采用Clustalx 1.83[5]將序列對齊，利用MEGA 5.0[6]軟件進行系統發育分析，并以自展法（bootstrap）進行檢測，循環1 000次，采用鄰接法構建系統發育樹，其中虎皮香菇（Lentinula tigrinus）作為外群。利用Clustalx 1.83[5]軟件將實驗菌株序列及部分親緣關系較近的代表性菌株序列進行比對，找出不同序列間的堿基差異。

2 結果與分析

2.1 分離菌株的形態特征 在PDA培養基上25℃培養，從表面消毒的子實體邊緣生長出白色菌落，具有典型的腐生真菌形態特征。菌落正面白色，棉質，質地緊密，中央隆起或稍有皺褶，邊緣疏松，背面泛黃色或淡褐色。

2.2 DNA序列組成分析 靈芝菌株Wzs1進行了rDNA-ITS的擴增和測序。擴增產物包括ITS1-5.8S-ITS2區段以及部分18S、25S區段，其中菌株Wzs1擴增長度為674bp，ITS1、5.8S、ITS2序列長度分別為206bp、158bp、215bp，同時將測得的序列提交到GenBank（HQ689698）。

2.3 系統發育分析 利用MEGA5.0軟件進行系統發育分析，構建NJ樹branch length=0.391。系統發育樹結構顯示：靈芝菌株Wzs1與G.resinaceum類群聚為一支，自展值為26%；這一支包含了G.resinaceum、G.tenue、G.subamboinens和G.weberianum共4個種（圖1）。此外，rDNA-ITS系統發育樹顯示靈芝不同種間親緣關系的遠近，同時G.japonicum與G.sinense這2個種的4株菌株聚為一支，與此相似的還有G.australe與G.adspersum，G.applanatum與G.lipsiense，G.pseudoferreum與G.philippii 6個種，其它各個種菌株各自聚為一支，這些結果反映了rDNA-ITS能夠較好地對不同種菌株進行區分（圖1）。

2.4 DNA序列差異分析 將屬于G.resinaceum類群的9個菌株進行rDNA-ITS序列差異性比較，以序列的一端作為起始點，菌株Wzs1與其它8個菌株的差異主要分布在3個不同區域，分別位于90～140bp，160～200bp，420～460bp，這反映了菌株Wzs1與其它G.resinaceum類群菌株產生差異可能由這3個差異顯著的片段決定（圖2）。

3 討論與結論

隨著分子生物學技術的發展，靈芝真菌的形態分類容易受到外界環境的影響被越來越多的研究證明，形態數據難以準確區分不同種的菌株[3]。采用rDNA-ITS序列研究發現，中國栽培靈芝菌株中樹舌亞屬、紫芝組的菌株各自聚成一組，赤芝組的菌株分成3組，85.7%赤芝組菌株均聚于同一組，且樹舌亞屬、紫芝組和赤芝組間的遺傳差異較大，赤芝組內存在一定的遺傳差異，但多樣性并不豐富[7-8]。菌株Wzs1與G.resinaceum類群聚為一支，說明這些靈芝遺傳關系較為緊密。此外，Wzs1靈芝子實體也具有類似G.resinaceum類群4種靈芝的形態特征。因此，系統發育分析結果表明，菌株Wzs1可能與G.resinaceum類群較相近，但與G.resinaceum這個種有較明顯的區別，并且序列差異比較分析也表明Wzs1與G.resinaceum類群其它菌株存在3個不同區域的差異，這也反映了菌株Wzs1僅與這一類群相近但有別于G.resinaceum的菌株。這些結果為進一步研究海南產靈芝菌株的系統發育學信息提供了參考借鑒。

參考文獻

[1]Chang S T，Miles P G.Mushrooms cultivation，nutritional value，medicinal effect，and environmental impact[M].CRC Press，2004：357-372.

[2]吳興亮，戴玉成.中國靈芝圖鑒[M].北京：科學出版社，2005：1-14.

[3]陳永敢，陳光宙，袁學軍，等.中國產Ganoderma lucidum的系統發育學分析及栽培技術研究[J].北方園藝，2014，08（1）：92-95，96.

[4]Chen Y G，Ji Y L，Yu H S，et al.A new Neotyphodium species from Festuca parvigluma Steud.grown in China [J].Mycologia，2009，101（5）：681-685.

[5]Thompson J D，Higgins D G，Gibson T J.Clustal W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice [J].Nucleic Acids Res，1994，22：4673-4680.

[6]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Mol Biol Evol，2011，28：2731-2739.

[7]蘇春麗，唐傳紅，張勁松，等.基于rDNA-ITS序列探討中國栽培靈芝菌株的親緣關系[J].微生物學報，2007，47（1）：11-16.

[8]Zheng L Y，Jia D H，Fei X F，et al.An assessment of the genetic diversity within Ganoderma strains with AFLP and ITS PCR-RFLP [J].Mycol Res.，2009，164：312-321.

（責編：張宏民）