銀杏黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷及縫隙連接蛋白43的作用

魏曉倩，王 雄，趙 慧

銀杏黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷及縫隙連接蛋白43的作用

魏曉倩1，王 雄2，趙 慧1

目的 研究銀杏黃酮對大鼠心肌缺血再灌注(I/R)損傷(MIRI)及縫隙連接蛋白43(Cx43)的作用，并探討其可能機制。方法 將32只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、I/R組、金納多組、銀杏內酯組，每組8只。建立在體心肌I/R損傷模型，HE染色法觀察大鼠心肌組織形態學改變；黃嘌呤氧化酶法測定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)濃度；免疫組化法檢測Cx 43的表達及分布特點；觀察記錄再灌注30 min內各組心律失常情況，進行評分比較。結果 與I/R組比較，金納多組心肌壞死減少，SOD增高、MDA降低，Cx43表達增多且多分布在端端連接處，心律失常發生次數減少；銀杏內酯組SOD增高、MDA降低、心律失常評分降低(P>0.05)，心肌細胞壞死及Cx43表達無明顯異常。 結論 銀杏黃酮可對抗大鼠心肌缺血再灌注損傷以及減少Cx43表達異常，進而改善MIRI性心律失常，其作用機制可能與抗細胞氧化應激及減少縫隙連接蛋白表達異常有關。

缺血再灌注損傷；心律失常；銀杏黃酮；氧化應激；縫隙連接蛋白43

目前對于急性心肌梗死的治療主要為血管再通，隨之產生的再灌注損傷越來越被重視，其中再灌注性心律失常也較常見。有研究表明，銀杏黃酮具有抗心肌缺血再灌注損傷(MIRI)及抗氯化鋇所致心律失常的作用[1-2]。縫隙連接蛋白43(Cx43)表達異常是心律失常發生中較為認可的機制之一[3]。本實驗探究銀杏黃酮對MIRI的作用以及是否能減少Cx43表達異常，探究可能機制，以期為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 兔抗鼠Cx43多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(均購于武漢博士德公司)，金納多注射液(5 mL：17.5 mg；其中銀杏黃酮苷4.2 mg，約24%，銀杏內酯1.05 mg 約6%，臺灣濟生化學制藥廠股份有限公司)，銀杏內酯注射液(2 mL；10 mg；成都百裕科技制藥有限公司)，HX 200動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)，RM6240B型生理實驗系統(成都儀器廠)，分光光度計(漢唐儀器廠)，數字病理掃描系統(美國aperio公司Scanscope)。

1.2 動物模型建立 SD大鼠稱重，以20%烏拉坦(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰位固定，氣管插管連接呼吸機，監測Ⅱ導聯心電圖，開胸暴露心臟，于左心耳根部與肺動脈圓錐中間以下約2 mm處，以6-0無創縫合線穿過冠脈左前降支(LAD)，套管夾畢法阻斷LAD血流。以心電圖ST段抬高(≥0．15 mV)且相應區域心肌發紺，放松后ST-T回落50%以上，且有心律失常發生為建模成功標準。

1.3 分組及干預措施 將32只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、I/R組、金納多組、銀杏內酯組，每組8只。假手術組：開胸穿線，麻醉45 min；I/R組、金納多組及銀杏內酯組：開胸穿線，結扎LAD 15 min，再灌注30 min。藥物處理措施：金納多組及銀杏內酯組分別于術前3 d腹腔注射金納多注射液12.5 mg/(kg·d)和銀杏內酯注射液2.7 mg/(kg·d)，手術當日缺血前5 min于股靜脈分別緩慢推注同前劑量的金納多注射液和銀杏內酯注射液；假手術組及I/R組分別予等量生理鹽水。

1.4 觀測指標

1.4.1 心肌組織病理學觀察(HE染色) 取缺血再灌注心肌組織固定、脫水、包埋、切片、脫蠟，蘇木素伊紅染色，中性樹脂封片，光鏡下觀察。

1.4.2 血清SOD和MDA測定 再灌注30 min時于腹主動脈取血3 mL，離心，將上清液封存于-20℃冰箱，檢測前解凍，按試劑盒說明添加標本及試劑，分光光度計檢測A值，計算SOD活性和MDA濃度。

1.4.3 免疫組化法觀察Cx43表達及分布 取缺血再灌注心肌組織固定、脫水、包埋、切片、脫蠟，Cx43免疫組化染色，DAB顯色、蘇木素復染、封片，光鏡下觀察，掃描、拍照。

1.4.4 心律失常評分 記錄再灌注30 min內心律失常的發生，查閱相關文獻[4]對各組心律失常進行評分，標準如下：0分：室性早搏(VP)數<5；1分：VP數≥5；2分：只有1次<60 s的室速(VT)；3分：有多次VT，總持續時間<60 s，或只有1次≥60 s；4分：有多次VT，總持續時間≥60 s；5分：可恢復的室顫(VF)；6分：不可恢復VF。

2 結 果

2.1 HE染色 假手術組心肌纖維排列整齊，未見水腫斷裂，間質無炎癥細胞浸潤。I/R組及銀杏內酯組心肌纖維排列紊亂，部分斷裂，間質高度水腫、有炎癥細胞浸潤；金納多組心肌纖維排列基本正常，結構清楚，間質輕度水腫，少量炎細胞浸潤。

2.2 血清SOD和MDA測定(見表1) 與假手術組比較，I/R組SOD和MDA差異有統計學意義。與I/R相比，金納多組SOD和MDA差異有統計學意義；銀杏內酯組差異無統計學意義。

表1 4組大鼠SOD活性、MDA含量表(±s)

2.3 免疫組化法觀察Cx43表達及分布 I/R組較假手術組表達減少且散亂；金納多組較I/R組及銀杏內酯組表達增多且分布整齊、側移減少；銀杏內酯組和I/R組表達無明顯差異。

2.4 心律失常評分(見表2) 與假手術組比較，I/R組室早、室速、室速持續時間、室顫、室顫持續時間等心律失常發生數目均增加，心律失常的評分升高(P<0.05)。與I/R組比較，金納多組室早等心律失常發生數目均減少，心律失常的評分降低(P<0.05)；與I/R組比較，銀杏內酯組室早等心律失常發生數減少，心律失常評分降低，但無統計學意義(P>0.05)。

表2 4組大鼠心律失常發生情況及評分

3 討 論

1960年Jennings等[5]提出心肌缺血再灌注損傷，且隨著血管再通治療的成熟，對MIRI研究越來越多。目前認為MIRI機制有氧化應激、能量代謝障礙、細胞凋亡等，MIRI會導致心律失常、梗死面積擴大、心功能低下等表現[6]。

有研究表明[6-7]，再灌注時氧自由基會大量產生并蓄積，進而對細胞內蛋白、核酸、心肌細胞膜K+-ATP通道等產生影響，導致心肌細胞損傷以及心律失常的發生。本實驗測定氧化應激指標超氧化物歧化酶和氧化應激產物丙二醛，來反應機體自由基的清除能力、受氧化應激的損傷程度；通過HE染色觀察細胞壞死情況。實驗中I/R組較假手術組氧化應激水平升高(即SOD降低、MDA升高)，細胞壞死更嚴重；進一步印證氧化應激會導致心肌損傷。與I/R組比較，金納多組氧化應激水平降低(即SOD活性增加、MDA含量降低)，細胞壞死減少，說明金納多可抑制氧化應激；而同等含量的銀杏內酯未表現出明顯的抗氧化應激作用，銀杏黃酮可通過抑制氧化應激產生抗MIRI作用。這與沈秀珍等[8]的研究結果一致。

Rakotovao等[7]研究提出I/R產生的氧化應激產物可使Cx43表達減少且去磷酸化，促發心律失常。Cx43是一種主要位于閏盤處的磷蛋白，主要分布在心肌細胞端端連接處，為相鄰細胞之間電及化學信號的快速交流通道，其功能狀態為磷酸化，分布異常可導致信號傳導障礙引發心律失常[3]。本實驗觀察到I/R組較假手術組Cx43表達減少且分布紊亂，心律失常評分增加；金納多組較I/R組Cx43表達增加，側移減少，心律失常評分降低。而銀杏內酯組無明顯變化。可認為銀杏黃酮具有減少Cx43表達異常，改善MIRI性心律失常的作用，這與也與Rakotovao等研究互相印證。

銀杏黃酮可對抗大鼠MIRI以及減少Cx43表達異常，改善MIRI性心律失常，其作用機制可能與抗細胞氧化應激及減少縫隙連接蛋白表達異常有關[8]。

[1] 趙艷榮，張國斌，邴飛虹.銀杏黃酮對心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌保護作用及其作用機制研究[J]；實用心腦肺血管病雜志，2016，24( 3)：38-42.

[2] 張明艷，韓艷梅，邸丕凡，等.銀杏黃酮抗心律失常作用的研究[J]，中國誤診學雜志2003，3(5)：695-696.

[3] 王榮，張存泰，王琳.心臟縫隙連接蛋白Cx43磷酸化水平與室性心律失常的關系[J].中國心臟起搏與心電生理雜志，2007，21(6)：538-540.

[4] 劉麗，向繼洲.SIPI926類化合物以及β2-腎上腺素受體激動劑克倫特羅抗缺血-再灌注性心律失常作用及機制[D].武漢：華中科技大學，2011.

[5] Jennings RB，Sommers HM，Smyth GA，et al．Myocardial necrosis induced by temoporary occlusion of a coronary artery in the dog[J]．Arch Pathol，1960，70：68-78；

[6] 鄭波，張奇惠，李躍榮.心肌缺血再灌注損傷機制研究進展[J].濱州醫學院學報，2008，31(2)：121-123.

[7] Gskotovso A，Tanguy S，Toufektsian MC，et al．Selenium status as determinant of connexin-43 dephosphorylation in exvivo isehemic/reperfnsed ratmyocardium[J]．J Trace Elem Med Biol，2005，9(1)：43.

[8] 沈秀珍，王凌，方毅華.銀杏總黃酮通過調節自噬減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的研究[J].安徽醫藥，2016，20(6)：1065-1067.

(本文編輯王雅潔)

1.山西醫科大學在讀研究生(太原030001)；2.山西醫科大學第一醫院

王雄，E-mail：SX wang xiong@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.012

1672-1349(2017)03-303-03

2016-11-07)

引用信息：魏曉倩，王雄，趙慧，等.銀杏黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷及縫隙連接蛋白43的作用[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(3)：303-305.