CYP2W1在胃癌中的表達及其生物學功能研究

劉東升，黃天臣

（1.河南護理職業(yè)學院，河南 安陽 455000；2.安陽市腫瘤醫(yī)院，河南 安陽 455000）

CYP2W1在胃癌中的表達及其生物學功能研究

劉東升1，黃天臣2

（1.河南護理職業(yè)學院，河南 安陽 455000；2.安陽市腫瘤醫(yī)院，河南 安陽 455000）

目的 探討CYP2W1在胃癌組織中的表達情況，研究其生物學功能。方法 采用免疫組化法檢測326例胃腺癌組織及326例正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白的表達情況；采用Western blotting實驗隨機檢測10例胃腺癌組織和10例正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白的表達情況；建立4組胃癌組織、1組正常胃黏膜組織細胞系，應用實時熒光定量PCR檢測各組細胞系中CYP2W1 mRNA的表達量；通過平板克隆、劃痕愈合實驗研究其對胃癌細胞增殖和遷徙侵襲能力的影響。結(jié)果胃癌組織中，CYP2W1蛋白表達明顯高于正常胃黏膜組織（P＜0.05）。胃癌細胞中CYP2W1 mRNA的表達量明顯高于正常胃黏膜細胞（P＜0.05）。CYP2W1陽性胃癌細胞的克隆形成數(shù)量明顯高于正常胃黏膜細胞（P＜0.05）。24 h/48 h CYP2W1陽性胃癌細胞劃痕修復速率明顯高于正常胃黏膜細胞，CYP2W1陽性胃癌細胞劃痕愈合面積明顯大于正常胃黏膜細胞，二者比較差異有顯著性（P＜0.05）。結(jié)論 CYP2W1僅在胃癌組織中表達，在正常胃黏膜組織中不表達；CYP2W1與胃癌細胞的生長增殖及遷徙侵襲能力明顯相關(guān)。

胃癌；CYP2W1；增殖；侵襲

胃癌（gastric cancer，GC）為消化道腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤。關(guān)于胃癌發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移的基因及分子標記物的研究對胃癌的早期診斷、治療、預后評估具有重要的臨床意義。CYP2W1為細胞色素P450超家族的新成員之一，具有腫瘤特異性。關(guān)于胃癌中CYP2W1的表達及其與胃癌增殖及侵襲能力關(guān)系的研究，迄今尚未見國內(nèi)外報道。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源

收集2010年3月至2015年3月于安陽市腫瘤醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)治療的326例胃癌患者的手術(shù)標本，以多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，分別用于HE染色及免疫組織化學染色。新鮮標本保存于液氮中，用于Western blot實驗。正常胃黏膜組織：取自距癌組織邊緣5 cm以上的手術(shù)標本，經(jīng)病理學證實為正常胃黏膜組織。人胃癌細胞系（BGC-823、SGC-7901、MKN-28、MGC-803）由上海社會科學院細胞庫提供，常規(guī)傳代培養(yǎng)。正常胃黏膜上皮細胞系（GES-1）購于上海復祥生物公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 染色步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用雙評分半定量積分法，對CYP2W1的免疫組化結(jié)果進行分析。以出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒的細胞作為陽性細胞，CYP2W1的陽性部位在細胞質(zhì)，高倍（400倍）鏡下，隨機選取5個視野（每個視野計數(shù)細胞數(shù)不少于200個）。陽性細胞＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；陽性強度評分：細胞無染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。將陽性細胞數(shù)得分和陽性強度得分相乘，0分為（-），1～4分為（+），5～8分為（++），≥9分為（+++），將（++）和（+++）樣本判定為陽性表達，（-）和（+）樣本判定為陰性表達。

1.2.2 Western blot實驗 使用細胞組織快速裂解液裂解組織，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白質(zhì)含量，-70℃保存。制備SDS-PAGE，蛋白電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，將硝酸纖維素膜放入封閉液中，置于37℃恒溫搖床上，低速搖動封閉2 h。將一抗按1∶1 000稀釋（參考抗體說明書），4℃搖床低速搖動過夜孵育。洗脫緩沖液洗滌3次，時間分別為15 min、10 min、5 min。洗滌后進行二抗孵育，二抗為羊抗兔，按1∶4 000稀釋，置于37℃恒溫搖床上，低速搖動孵育45 min。洗脫緩沖液洗滌3次，每次5 min。ECL顯色，暗房中曝光，顯影定影后膠片保存攝片，掃描后用Bandscan 5.0軟件進行灰度分析。

1.2.3 實時熒光定量PCR 引物設計：CYP2W1上游引物AAGACGGTGGTGCTGACGG，下游引物GCTGGATGAGCTGGAAGATGG，長度106 bp；GAPDH上游引物TCAAGAAGGTGGTGAAGCA，下游引物AAAGGTGGAGGAGTGGGT，長度113 bp。引物由上海生工生物公司合成。提取胃癌細胞系（BGC-823、SGC-7901、MKN-28、MGC-803）和正常胃黏膜上皮細胞（GES-1）中總RNA，紫外分光光度計測量總RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qPCR擴增。qPCR反應條件為：94℃、5 min（預變性）一個循環(huán)；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、90 s，共35個循環(huán)；72℃、10 min，4℃、2 min。對擴增曲線所獲得的Ct值進行分析，利用以前報道的2-△△Ct計算方法，算出CYP2W1mRNA的相對表達量。

1.2.4 平板克隆形成實驗 選取對數(shù)生長期（BGC-823、GES-1）細胞，常規(guī)處理，重懸成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至1× 103/ml，接種，連續(xù)培養(yǎng)。出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止細胞培養(yǎng)，PBS液漂洗，固定，加入姬姆薩染液，沖洗，干燥。計數(shù)肉眼可見克隆形成的數(shù)量，或在低倍鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)。克隆形成率=（克隆數(shù)/200）×100%。

1.2.5 劃痕愈合實驗 24孔板背后劃線，將BGC-823、GES-1以0.25%胰酶消化，制備培養(yǎng)單層細胞。當細胞鋪滿全空時，劃痕，記錄鏡下劃痕區(qū)相對距離。繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0 h、24 h、48 h用PBS洗掉劃落的細胞，于倒置顯微鏡下拍照。倒置顯微鏡下測量細胞向致傷區(qū)遷移的相對距離，計算細胞實際遷移距離。采用Image J軟件檢測劃痕面積，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（1-各時間點劃痕面積/開始的劃痕面積）×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。免疫組化結(jié)果相關(guān)分析采用χ2檢驗。統(tǒng)計數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，使用獨立樣本t檢驗，多個樣本均數(shù)比較應用單因素方差分析（One-way ANOVA），以α=0.05為顯著性水準。

2 結(jié)果

2.1 CYP2W1蛋白在胃癌組織與正常胃黏膜組織中的表達

CYP2W1蛋白主要表達于癌細胞胞質(zhì)，胞膜也有不同程度表達，呈淺黃至棕黃色。胃癌組織的CYP2W1陽性表達率為26.69%，顯著高于正常胃黏膜組織（0.00%）。胃癌組織與正常胃黏膜組織CYP2W1的陽性表達率有顯著性差異（χ2=100.396，P=0.000），見表1。

表1 胃癌與正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白表達比較

2.2 Western blot實驗胃癌組織及正常胃黏膜組織CYP2W1蛋白的表達

應用Western blotting實驗對隨機選取的10例胃癌組織及10例正常胃黏膜組織中的CYP2W1蛋白表達水平進行檢測。結(jié)果顯示，胃癌組織中CYP2W1蛋白表達水平顯著高于正常胃黏膜組織（見表2），差異有顯著性（P＜0.05）。

表2 胃癌與正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白表達情況

2.3 實時熒光定量PCR檢測不同胃癌細胞中CYP2W1 mRNA水平

4株胃癌（BGC-823、SGC-7901、MKN-28、MGC-803）細胞中CYP2W1 mRNA表達水平明顯升高，而正常胃黏膜細胞（GES-1）中CYP2W1 mRNA基本無表達，二者比較差異有顯著性（P＜0.05）。此外，BGC-823細胞中CYP2W1 mRNA表達水平顯著高于SGC-7901、MKN-28、MGC-803細胞（P＜0.05），而后3種細胞CYP2W1 mRNA表達水平無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 BGC-823及GES-1細胞平板克隆形成實驗結(jié)果

正常胃黏膜細胞（GES-1）克隆形成的數(shù)量（25.18±4.36）明顯少于CYP2W1陽性胃癌細胞（BGC-823）克隆形成的數(shù)量（57.92±8.17），差異有顯著性（P＜0.05）。正常胃黏膜細胞（GES-1）克隆形成率（12.59%）明顯低于CYP2W1陽性胃癌細胞（BGC-823）克隆形成率（29.96%），差異有顯著性（P＜0.05），表明CYP2W1陽性胃癌細胞的增殖能力明顯增強。

2.5 劃痕實驗檢測胃癌細胞的遷徙侵襲能力

應用劃痕實驗檢測胃癌細胞的遷徏侵襲能力，按劃痕實驗要求逐步操作，拍照記錄0 h、24 h、48 h細胞的遷移變化，檢測劃痕面積，計算劃痕愈合率。結(jié)果顯示：24 h/48 hCYP2W1陽性胃癌細胞（BGC-823）劃痕修復率明顯高于正常胃黏膜細胞（GES-1），CYP2W1陽性胃癌細胞（BGC-823）劃痕愈合面積明顯大于正常胃黏膜細胞（GES-1），二者比較差異有顯著性（P＜0.05），表明CYP2W1陽性胃癌細胞的遷徙侵襲能力明顯增強。

3 討論

臨床研究表明，CYP2W1作為一種特異性的腫瘤因子在近30%的結(jié)腸癌中表達，而在正常健康組織中不表達或無意義[1，2]。Stenstedt K等[3]應用免疫組化法檢測CYP2W1在235例II期和III期結(jié)腸癌中的表達情況。結(jié)果顯示：CYP2W1在30%的腫瘤中高水平表達，CYP2W1陽性表達水平與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。有學者研究發(fā)現(xiàn)，CYP2W1在結(jié)直腸癌原發(fā)性腫瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移進展過程中的表達呈升高趨勢，1/3的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、近一半的肝轉(zhuǎn)移患者CYP2W1高表達。

本研究結(jié)果：326例胃癌組織中，87例CYP2W1表達陽性，陽性表達率為26.69%。顯著高于正常胃黏膜組織（0.00%），胃癌組織與正常胃黏膜組織CYP2W1陽性表達率有顯著性差異（χ2=100.396，P=0.000）。應用Western blotting實驗隨機檢測10例胃腺癌組織和10例正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白表達情況，進一步證實該結(jié)論。采用平板克隆形成實驗檢測BGC-823細胞增殖能力，結(jié)果顯示：BGC-823克隆形成數(shù)量明顯高于GES-1，差異有顯著性（P＜0.05）。劃痕愈合實驗顯示：24 h/48 hBGC-823劃痕愈合率明顯高于GES-1，BGC-823劃痕愈合面積明顯大于GES-1，差異有顯著性（P＜0.05）。

研究表明[4]，在結(jié)直腸癌細胞系實驗中，表達CYP2W1的細胞系（SW480）顯示兩種化合物：ICT2705和ICT2706，轉(zhuǎn)換后將CYP2W1共價結(jié)合到DNA，導致細胞死亡，而化合物本身對腫瘤細胞無傷害作用。異種移植研究發(fā)現(xiàn)，在SCID小鼠體內(nèi)移植表達CYP2W1的結(jié)直腸腫瘤細胞，然后應用ICT2706治療，已顯示出完全抑制腫瘤細胞生長但對動物本身無明顯傷害的可喜結(jié)果。該研究證明，ICT2705和ICT2706這兩種混合物，能夠被CYP2W1激活而成為有效的抗腫瘤劑。CYP2W1作為腫瘤靶向治療的一種新的藥物治療靶標，可能成為腫瘤治療的又一方法。

[1]Karlgren M，Gomez A，Stark K，et al.Tumor-specific expression of the novel cytochrome P450 enzyme，CYP2W1[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，341（2）：451-458.

[2]Gomez A，Karlgren M，Edler D，et al.Expression of CYP2W1 in colon tumors：regulation bygene methylation[J].Pharmacogenomics，2007（8）：1315-1325.

[3]Stenstedt K，Hallstrom M，Johansson I，et al.The expression of CYP2W1：a prognostic marker incolon cancer[J].Anticancer Res，2012（32）：3869-3874.

[4]Travica S，Pors K，Loadman P M，et al.Colon cancer-specific cytochrome P4502W1 converts duocarmycin analogues into potent tumor cytotoxins[J]. Clin Cancer Res，2013（19）：2952-2961.

R735.2

B

1671-1246（2017）03-0151-02