高效液相色譜法同時測定復方褪黑激素片中維生素B6與褪黑激素的含量

徐碩　徐文峰　金鵬飛

[摘要] 目的 應用高效液相色譜（HPLC）技術，建立同時測定復方褪黑激素片中維生素B6和褪黑激素含量的方法。 方法 采用Alltima C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），以50 mmol/L磷酸二氫銨溶液（磷酸調至pH 3.0）-乙腈為流動相，梯度洗脫，流速0.5 mL/min，檢測波長278 nm，柱溫30℃，進樣體積10 μL，對復方褪黑激素片中的維生素B6和褪黑激素進行含量測定。結果 維生素B6和褪黑激素檢測濃度分別在80.34～401.7 mg/L（r=0.9997）和8.50～42.5 mg/L（r=0.9999）范圍內與峰面積呈良好的線性關系；精密度和穩(wěn)定性良好，相對標準偏差（RSD）均<0.8%；回收率良好，維生素B6和褪黑激素的平均回收率（n=9）分別為100.4%和98.86%，RSD分別為0.42%和0.86%。復方褪黑激素片中維生素B6平均含量為14.14 mg/片，褪黑激素平均含量為0.9853 mg/片。 結論 該方法準確、簡單、快速，可用于同時測定復方褪黑激素片中維生素B6和褪黑激素的含量。

[關鍵詞] 維生素B6；褪黑激素；高效液相色譜；含量測定

[中圖分類號] R927.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（c）-0142-05

[Abstract] Objective To develop a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the simultaneous determination of vitamin B6 and melatonin in Compound Melatonin Tablets. Methods An Alltima C18 column （150 mm × 4.6 mm， 5 μm） was used for the separation， with gradient elution of 50 mmol/L ammonium dihydrogen phosphate （adjusted pH to 3.0 with H3PO4） and acetonitrile as the mobile phase at the flow rate of 0.5 mL/min. The detection wavelength was set at 278 nm. The column temperature was 30℃ and injection volume was 10 μL. Vitamin B6 and melatonin in Compound Melatonin Tablets were quantified by the established method. Results The liner range of vitamin B6 and melatonin was 80.34-401.7 mg/L （r=0.9997） and 8.50-42.5 mg/L （r=0.9999） respectively. The precision and stability were satisfactory， and the relative standard deviation （RSD） were less than 0.8%. The average recoveries （n=9） was 100.4% （RSD=0.42%） and 98.86% （RSD=0.86%） for vitamin B6 and melatonin respectively. The average contents of vitamin B6 and melatonin in Compound Melatonin Tablets were 14.14 mg/tablet and 0.9853 mg/tablet. Conclusion The established method is accurate， simple and rapid， and can be utilized for simultaneous determination of vitamin B6 and melatonin in Compound Melatonin Tablets.

[Key words] Vitamin B6； Melatonin； HPLC； Determination

褪黑激素（melatonin，MLT）化學名稱為N-乙酰基-5-甲氧基色胺，主要是由哺乳動物和人類松果體產生、分泌的一種吲哚類物質[1-2]。褪黑激素是一種人體內分泌系統(tǒng)的調節(jié)劑，可將內源性生物節(jié)律的周期、位相調整到與環(huán)境周期同步，具有鎮(zhèn)靜、催眠、調節(jié)睡眠-覺醒、改善時差反應綜合征的作用。在延續(xù)人體衰老和抵抗老年性疾病方面具有一定作用，某些腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展也與褪黑激素的獨特晝夜排泌節(jié)律相關[1，3-6]。維生素B6對智力和體力的提高具有促進作用，能調節(jié)血液中的葡萄糖水平，維持甲狀腺、腎上腺和性腺的正常功能，改善大腦物質的新陳代謝[7-9]。復方褪黑激素片是以高純度的褪黑素、維生素B6為原料制成的具有改善睡眠作用的保健品，適用于失眠者、睡眠質量差、易驚醒者，片劑中加入維生素B6有助于提高免疫力。

隨著生命科學研究的不斷深入，人工合成褪黑激素的工藝已完成，該物質作為保健食品被廣泛應用。保健品中有效成分的含量高低對于保證其質量穩(wěn)定，發(fā)揮特定功能方面具有重要意義，因此對其進行含量測定是很有必要的。雖然已有報道，褪黑激素和維生素B6的含量測定方法[1-3，9-23]，但同時對這兩種成分進行含量測定的研究還未見報道。褪黑激素與維生素B6的化學結構、理化性質和色譜行為差異大，因此實現(xiàn)同時分析的難度較大。文獻報道的維生素B6含量測定方法使用離子對高效液相色譜法（HPLC）[9，13-23]，長期運行對色譜柱損害較大。

本研究應用HPLC技術，首次建立了同時測定保健品復方褪黑激素片中維生素B6和褪黑激素含量的方法，該方法準確、專屬性強，避免了離子對試劑、液相系統(tǒng)的損害，樣品制備操作簡便，可用于其質量控制，具有一定參考價值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260液相系統(tǒng)：配有G1311C四元梯度泵，G1329B自動進樣器，G1316A柱溫箱，G4212B DAD檢測器（Agilent Technologies，美國）；Mettler XP-205電子天平（瑞士，梅特勒公司）；KQ-800KDE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Millipore超純水處理系統(tǒng)。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，美國Fisher公司，批號：157753）；磷酸（色譜純，瑞士Fluka公司，批號：BCBB0522）；磷酸二氫銨（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20130121）；甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150917）；實驗用水為超純水。維生素B6（鹽酸吡多辛）對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100116-200502，純度100%）；褪黑激素對照品（上海源葉生物科技有限公司，純度98%）。復方褪黑激素片（規(guī)格：含維生素B6 12.2 mg/片，褪黑激素1 mg/片，批號：2067119、2057676和2049624，美國Natrol公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Alltima C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：50 mmol/L磷酸二氫銨溶液（磷酸調至pH 3.0）（A）-乙腈（B），梯度洗脫（梯度變化程序見表1），流速：0.5 mL/min；檢測波長：278 nm；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μL。在上述色譜條件下，維生素B6和褪黑激素色譜峰的理論塔板數(shù)分別為15 773和255 960。進樣前，所有溶液均用0.22 μm微孔濾膜濾過。見表1。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取維生素B6對照品約200 mg、褪黑激素對照品約20 mg，置100 mL量瓶中，加入甲醇-水（15∶85）適量，超聲使溶解，用甲醇-水（15∶85）稀釋至刻度，搖勻，即為混合儲備液。再精密量取混合儲備液1、2、2.5、3、5 mL于25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，獲得維生素B6濃度約為80、160、200、240、400 mg/L，褪黑激素濃度約為8、16、20、24、40 mg/L混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取片劑20片，精密稱定，研細，精密稱取粉末適量（約相當于維生素B6 10 mg，褪黑激素1 mg），置于50 mL量瓶中，加入甲醇-水（10∶90）適量，超聲30 min，加甲醇-水（10∶90）稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性溶液的制備

依據(jù)保健品說明書提供的配方，配制不含維生素B6和褪黑激素的空白溶液，按“2.3”項下操作，制備陰性溶液。

2.5 專屬性和系統(tǒng)適用性試驗

分別對陰性溶液、混合對照品溶液和供試品溶液進樣分析，考察樣品中其他成分和輔料對定量的干擾。陰性溶液、混合對照品溶液和供試品溶液的色譜圖顯示：樣品中其他成分和輔料不干擾維生素B6和褪黑激素的測定。維生素B6和褪黑激素的分離度良好，理論板數(shù)均> 15 000。結果見圖1。

2.6 線性關系考察、檢測限及定量限

分別精密吸取“2.2”項下各濃度對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以峰面積為縱坐標，濃度（mg/mL）為橫坐標作標準曲線，得到回歸方程和線性相關系數(shù)（r）。維生素：B6 Y=26 480X+180.52，r=0.9997，線性范圍80.34～401.7 mg/L；褪黑激素：Y=27 590X+2.6193，r=0.9999，線性范圍8.50～42.5 mg/L。

將對照品溶液逐級稀釋后，以信噪比（S/N）約為3.0時的濃度為各成分的檢測限（LOD），S/N約為10.0時的濃度為各成分的定量限（LOQ），測得維生素B6的LOD和LOQ分別為0.0086、0.026 mg/L，測得褪黑激素的LOD和LOQ分別為0.085、0.28 mg/L。

2.7 精密度試驗

對批號為2067119的一份供試品溶液連續(xù)進樣6次，計算得到維生素B6和褪黑激素色譜峰峰面積的RSD分別為0.021%和0.19%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.8 重復性試驗

對批號2067119的樣品獨立制備供試品溶液6份，分別進樣分析，計算得到維生素B6和褪黑激素含量的RSD分別為2.21%和1.52%（n=6），說明方法的重復性良好。

2.9 回收率試驗

取空白基質約0.29 g，精密稱定，再分別精密加入“2.2”項下混合儲備液4、5、6 mL，按照“2.3”項下操作，制備各回收率溶液，進樣測定。每個濃度制備3份，共9份樣品。以實際測得量和理論加入量的比值作為回收率，計算回收率的RSD，結果見表2。表明方法回收率良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗

對批號為2067119的供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，計算得到24 h內維生素B6和褪黑激素色譜峰峰面積的RSD分別為0.11%和0.76%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.11 樣品測定

應用建立的方法對批號為2067119、2057676、2049624的復方保健品片進行含量測定，每個樣品測定2份，取平均值。測定結果見表3。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

維生素B6的紫外譜圖在218、256、292、326 nm處有最大吸收，褪黑激素的紫外譜圖在198、224、278 nm處有最大吸收，褪黑激素在樣品中含量較低，兼顧兩種成分綜合考慮，選擇278 nm作為檢測波長。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

維生素B6為水溶性維生素，極性大，在堿液中易破壞，在酸液中穩(wěn)定，褪黑激素與維生素B6化學結構不相關，理化性質和色譜行為差異大，因此實現(xiàn)同時分析的難度較大。本實驗考察了甲醇-水、甲醇-20 mmol/L磷酸二氫銨（磷酸調至pH 3.0）、甲醇-50 mmol/L磷酸二氫銨、甲醇-0.04%戊烷磺酸鈉（用冰醋酸調至pH 3.0）、乙腈-10 mmol/L磷酸二氫銨（含0.01%庚烷磺酸鈉）、乙腈-10 mmol/L磷酸二氫銨（含0.01%庚烷磺酸鈉，用磷酸調至pH 3.0）、乙腈-50 mmol/L磷酸二氫銨、乙腈-50 mmol/L磷酸二氫銨（磷酸調至pH 3.0）作為流動相對維生素B6和褪黑激素色譜峰的影響。發(fā)現(xiàn)維生素B6峰形受流動相影響較大，色譜峰容易出現(xiàn)前延或拖尾，本實驗通過比較多種流動相發(fā)現(xiàn)，以乙腈-50 mmol/L磷酸二氫銨（磷酸調至pH 3.0）為流動相時兩種目標成分峰形均很好，對稱因子為1.0，維生素B6和褪黑激素色譜峰的理論塔板數(shù)分別為15 773和255 960。目前國內外測定維生素B6文獻報道大多需采用含有離子對試劑的流動相[9，13-23]，長期運行會對液相系統(tǒng)和色譜柱造成較大損害，而本研究使用的流動相不需離子對試劑，且通過比較發(fā)現(xiàn)，維生素B6色譜峰的對稱性及理論塔板數(shù)更好。因兩種成分極性差異較大，用等度條件難以同時洗脫出來。考察了不同梯度洗脫程序以及比較了不同流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）的影響，在最終采用的色譜條件下兩種成分的保留時間適宜，方便分析檢測。

3.3 提取溶劑的選擇

本研究比較了用甲醇-水（50∶50）、甲醇-水（20∶80）、甲醇-水（10∶90）作為提取溶劑對維生素B6和褪黑激素的影響。結果顯示，褪黑激素的峰形和提取率無明顯變化，而維生素B6的峰形受甲醇比例的影響較大，當甲醇比例超過10%時，其峰形不佳，褪黑激素很易溶于甲醇，加入少量甲醇即可將其從樣品中提取完全，同時又能保證維生素B6的峰形較好，故最終選擇以甲醇-水（10∶90）作為提取溶劑。

[參考文獻]

[1] 吳俊文，陳通威.高效液相色譜法對褪黑激素片含量的測定[J].山西醫(yī)科大學學報，2004，35（3）：297.

[2] 王建華，王巍，廖鋒慧，等.RP-HPLC測定不同β-環(huán)糊精衍生物超分子包合物中褪黑激素的含量[J].光譜實驗室，2010，27（3）：815-820.

[3] 蘇燕，葉傳華.高效液相色譜法測定褪黑激素的含量[J].中國抗生素雜志，1999，24（2）：145-148.

[4] 伍彬，張嬌.褪黑激素研究進展[J].中國藥業(yè)，2009，18（14）：81-82.

[5] Borin TF，Arbab AS，Gelaleti GB，et al. Melatonin decreases breast cancer metastasis by modulating Rho-associated kinase protein-1 expression [J]. J Pineal Res，2016，60（1）：3-15.

[6] 王濤，方健，吳成如，等.褪黑激素對脊髓損傷的保護作用機制研究進展[J].安徽醫(yī)學，2016，37（7）：920-922.

[7] 劉耀.維生素B6的臨床應用現(xiàn)狀[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2014，8（10）：230-231.

[8] 陳敏，張伶俐，全淑燕，等.維生素B6臨床應用的安全性評價[J].中國藥學雜志，2016，51（1）：65-69.

[9] 徐倩昱，陳斌，郁穎佳，等.離子對反相高效液相色譜法測定復合維生素粉中維生素B2和B6的含量[J].中國臨床藥學雜志，2008，17（1）：48-50.

[10] 劉淳，鄭毅.高效液相色譜法測定保健食品中褪黑激素的含量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，1997，7（6）：384-385.

[11] 王英娟，步懷宇，賈敬芬，等.RP-HPLC法測定不同蘆薈中褪黑激素的含量[J].食品科學，2008，29（6）：350-352.

[12] 劉偉華，張貴友，戴堯仁.HPLC法測定黃芩葉、花、種子中褪黑激素的含量[J].植物學通報，2003，20（1）：75-79.

[13] 李富賢，韓東平，米彩峰，等.離子對HPLC法測定更年靈膠囊中維生素B6含量[J].西北藥學雜志，2009，24（5）：345-346.

[14] 王英鋒，梁建貞，張建博.反相離子對高效液相色譜法測定更年舒片中維生素B6的含量[J].藥物分析雜志，2009，29（6）：1019-1021.

[15] 王彬彬，姜靜，隋馨.復合維生素B片中維生素B6的含量測定[J].中國藥師，2008，11（2）：239-240.

[16] 王慧.HPLC法測定維生素B6乳膏中維生素B6的含量[J].藥學研究，2014，33（2）：94-95.

[17] 孫清，巴曉革，史磊.HPLC法同時測定更年安軟膠囊中維生素B1、維生素B6的含量[J].藥物分析雜志，2011， 31（4）：725-727.

[18] 申穎，申和平.HPLC法測定谷維素雙維B片中維生素B1和維生素B6的含量[J].中國藥品標準，2009，10（4）：286-288.

[19] Vidovia J，et al. Simultaneous determination of some water-soluble vitamins and preservatives in multivitamin syrup by validated stability-indicating high-performance liquid chromatography method [J]. J Chromatogr A，2008，1202（2）：155-162.

[20] Chen P，Atkinson R，Wolf WR. Single-laboratory validation of a high-performance liquid chromatographic-diode array detector-fluorescence detector/mass spectrometric method for simultaneous determination of water-soluble vitamins in multivitamin dietary tablets [J]. J AOAC Int，2008，92（2）：680-687.

[21] 李鋒武，劉鵬鳴，黃潔，等.HPLC法測定八維鈣鋅片中煙酰胺、維生素B1、B2、B6的含量[J].藥物分析雜志，2011， 31（6）：1150-1152.

[22] 沈麗平.HPLC測定維生素B6片含量測定方法的探討[J].海峽藥學，2016，28（2）：75-76.

[23] 江志華，黃奇建，康麗紅.HPLC法測定林可霉素維B6乳膏中維生素B6的含量[J].今日藥學，2014，24（3）：175-177.

（收稿日期：2016-09-26 本文編輯：李亞聰）