夏枯草對膽管癌細胞增殖及凋亡的作用*

伍旭明 許亞萍

浙江省中醫院 浙江 杭州 310006

夏枯草對膽管癌細胞增殖及凋亡的作用*

伍旭明 許亞萍#

浙江省中醫院 浙江 杭州 310006

夏枯草 人膽管癌細胞 增殖 凋亡

膽管癌是一種起源于膽道上皮的少見的惡性腫瘤，手術仍是目前主要的治療手段，但手術后生存率較低[1]。有研究表明夏枯草對多種腫瘤具有抑制作用，但是目前夏枯草對膽管癌的研究較少。因此本研究主要探討夏枯草對膽管癌QBC939和RBE細胞的作用，為臨床中醫輔助治療膽管癌提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑:夏枯草購于福建中醫藥大學國醫堂醫院。小牛血清、低糖DMEM培養基、胰蛋白酶等試劑均購自GIBICO公司；MTT、Hoechest33258、DMSO，內參購自sigma公司。Trizol為Invit rogen公司產品；逆轉錄試劑盒、dNTP、Taq DNA聚合酶為promega公司產品。由上海生工生物工程有限公司合成引物。

1.2 細胞培養:人QBC939、RBE膽管癌細胞購自上海中科院細胞庫,將細胞培養于含10%的胎牛血清,1×105IU/L青霉素及125mg/L鏈霉素，低糖DMEM培養基中，在37℃、5%CO2條件下進行培養，取生長至對數生長期的細胞用于實驗。

1.3 實驗方法:分述如下。

1.3.1 藥品的制備:對藥材以水煎法提取2h，加入75%的乙醇進行溶解，獲得夏枯草的粗提物，取夏枯草粗提物適量，精密稱定，溶解于DMSO中。經高壓滅菌后，于-20℃冰箱中保存。實驗時母液用DMEM培養基進行稀釋，獲得所需要的干預濃度。DMSO最終濃度控制在1%以下。

1.3.2 MTT比色實驗:取對數生長期細胞（1×105），用胰酶(EDTA)進行消化，接種于96孔培養板，待24小時細胞貼壁RBE后，加入不同濃度（50、100、200μg/ml）的夏枯草，每個藥物濃度設置5個復孔。設陰性對照組、陽性對照組順鉑(5g/ml)、空白對照組。細胞分別培養24、48、72h后，每孔加入濃度為5mg/ml MTT/PBS液l0μl，繼續培養4h后，棄上清，每孔中加入150μl二甲基亞砜溶解沉淀，在搖床上充分振蕩l0min，使結晶物溶解。在酶標儀上選擇570nm波長，測定各孔光吸收度值，計算夏枯草對膽管癌QBC939和細胞的抑制率。抑制率按公式計算:P抑制(%)=［(1-D藥物組)/D對照組)]×100%。

1.3.3 Hoechst 233258:取對數生長期細胞，調整細胞濃度為1×105，置于24孔板中。待細胞貼壁，加入100μg/ml的夏枯草，作用48h后，去掉培養基，用PBS洗滌細胞2次，4%的甲醇在4℃條件下固定細胞10min后，加入Hoechst233258染液(用PBS稀釋成5μg/ml)，在室溫條件下，細胞染色15min，選擇波長356nm，熒光顯微鏡(奧林巴斯FV1000)下觀察各組細胞的形態并攝像。

1.3.4 細胞凋亡測定:待細胞生長至對數生長期,收集細胞胰酶消化后,調整細胞濃度為1×106/ml，種于6孔培養板中，細胞貼壁后，用低、中、高劑量組50、100、200μg/ml的夏枯草分別處理48h后，離心收集細胞，冷PBS洗滌細胞2次，70%冷乙醇固定細胞，置入4℃冰箱中過夜保存備用。細胞在染色前用PBS洗去固定液，離心1000rpm，5min。加入500μl結合緩沖液重懸細胞，再各加5μl AnnexinⅤ-FITC及PI溶液，渦旋后，4℃避光孵育30min，進行流式細胞儀分析細胞凋亡率實驗重復3次。細胞凋亡的分析應用Becton Dickinson FACS分析系統和Mul ticycle軟件進行。

1.4 統計學方法:采用SPSS18.0統計軟件作統計分析。所有計量資料以±s表示,采用單因素方差分析進行組間差異的比較。以P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 夏枯草對QBC939和RBE細胞凋亡的影響:見表1。

表1 夏枯草對QBC939和RBE細胞凋亡的影響（±s）

表1 夏枯草對QBC939和RBE細胞凋亡的影響（±s）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.01。

組別空白對照組陰性對照組陽性對照組50μg/ml 100μg/ml 200μg/ml QBC939 12.32±0.32 12.52±0.38 35.20±0.52*14.01±0.52 43.25±0.35*53.15±0.42*RBE 12.45±0.38 12.60±0.47 35.64±0.65*14.25±0.58 44.02±0.46*54.25±0.48*

2.2 夏枯草對QBC939和RBE細胞增殖抑制率的影 響:見表2。

表2 夏枯草對QBC939和RBE細胞增殖抑制率的影響（±s，%）

表2 夏枯草對QBC939和RBE細胞增殖抑制率的影響（±s，%）

注:與空白對照組比較，*P＜0.0l。

組別空白對照組陰性對照組陽性對照組50μg/ml 100μg/ml 200μg/ml QBC939 0—0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 24—1.20±0.26 28.58±0.40*1.60±0.32 33.42±0.45*48.78±0.35*48—1.59±0.28 39.26±0.36*2.79±0.96 44.73±0.52*58.98±0.74*72—2.01±0.43 49.02±0.53*3.83±0.30 51.43±0.51*70.12±0.43*RBE 0—0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 0.01±0.04 24—1.18±0.29 28.62±0.46*1.62±0.37 33.48±0.49*48.58±0.35*48—1.56±0.31 39.33±0.40*2.82±0.98 44.76±0.56*59.04±0.76*72—2.12±0.48 49.13±0.59*3.85±0.35 51.51±0.56*70.20±0.48*

2.3 夏枯草對QBC939和RBE膽管癌細胞形態的影響: QBC939(B)以及RBE(C)細胞經Hoechst233258染色后，在熒光顯微鏡下，觀察細胞形態發生的變化。對照組（A）細胞核呈圓形，處理組（B,C）細胞出現皺縮，核發生碎裂，有凋亡小體出現，出現典型的凋亡改變。見圖1。

圖1 夏枯草對QBC939和RBE膽管癌細胞形態的影響

3 討論

夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunel la vulgaris L．的干燥果穗，因“夏至后即枯”而得名，是一味清火、明目、散結、消腫的傳統中藥,早在《神農本草經》中就記載“夏枯草，味辛、苦，主寒熱瘰疬，頭創，破瘕，散癭，結氣……”。現代臨床經驗證明單味夏枯草或與其他藥配伍，對治療肺癌、乳腺癌、腦膠質細胞瘤、淋巴瘤 等多種惡性腫瘤，均有較為滿意的效果[2]。夏枯草作為一種廉價、低毒、有效的抗腫瘤中藥，越來越引起人們的廣泛關注。

膽管癌的發病率目前逐年升高，其發病的原因不明，化療是治療膽管癌的一項重要手段，但缺乏敏感且有效的化療藥物[3]。因此，尋找有效的化療藥物是目前臨床的一項重要任務。現代臨床研究表明單味夏枯草或者其復方對淋巴瘤、血管瘤、甲狀腺腫瘤等惡性腫瘤，療效較好。目前夏枯草對膽管癌的研究較少，本研究主要探討夏枯草對膽管癌細胞株QBC939，RBE增殖及凋亡的影響。細胞的發生快速增殖是腫瘤細胞的主要特征之一，控制癌癥發展的一個重要途徑是遏制腫瘤細胞的快速增殖。膽管癌細胞QBC939及RBE經不同濃度的夏枯草分別處理24、48、72小時后，采用MTT法檢測細胞增殖的抑制情況。研究結果顯示，經中、高濃度（100、200μg/ml）夏枯草處理的膽管癌細胞，細胞的增殖抑制率增高，并隨著夏枯草藥物濃度的增加，作用時間的延長而增高，與對照組相比，有統計學差異。提示夏枯草能抑制膽管癌細胞QBC939及RBE的增殖，并呈時間濃度依賴性。腫瘤的發生、發展和細胞的凋亡密切相關。細胞凋亡是細胞在一定的生理或者病理條件下，在內在基因的調控下，細胞自動結束生命的一個過程。細胞凋亡時，細胞呈現染色質固縮、細胞核破碎，凋亡小體形成等特征性變化。本研究結果顯示，膽管癌細胞QBC939及RBE經100μg/ml的夏枯草處理48小時后，膽管癌細胞呈現典型的凋亡形態改變，而對照組細胞沒有發生凋亡形態的變化。同時流式細胞儀檢測結果顯示,經不同濃度（50、100、200μg/ml）夏枯草處理后細胞的凋亡率增加，與對照組相比，差異有統計學意義，并呈濃度依賴性。提示夏枯草能誘導膽管癌細胞株QBC939及RBE的凋亡參與抑制膽管癌的作用。本次研究結果與翁金月等[4]的研究報道基本一致。

綜上所述，研究表明在體外夏枯草能顯著抑制QBC939及RBE膽管癌細胞的增殖，并誘導其凋亡，為臨床輔助膽管癌的治療提供了實驗基礎，但其具體作用機制有待進一步深入研究。

[1]Wang H,Wang J,Wang H L.Mul tivariate analysis of survival rates in patients with hi lar cholangiocarinoma[J].J Surg Concepts Pract,2014,19(5):80-89.

[2]竇景云.夏枯草藥理作用及臨床應用研究進展[J].現代醫藥衛生，2013，29(7):1039-1041.

[3]國際肝膽胰學會中國分會,中華醫學會外科學分會肝臟外科學組.膽管癌診斷與治療——外科專家共識[J].中國實用外科雜志,2014,34（1）:1-5.

[4]翁金月,鄭良樸,張春椿.夏枯草促人結腸癌細胞凋亡的實驗觀察[J].浙江中醫雜志,2014,49（10）:772-774.

2016-09-16

全國名老中醫藥專家傳承工作室建設項目徐錫山名老中醫藥專家傳承工作室，編號：國中醫藥人教發[2013]47號

# 通訊作者：許亞萍，E-mai l：xyp_81@tom.com