人參皂苷對波動性高血糖大鼠腎臟Nrf2及NQO1表達(dá)的影響*

王 丹 黃 琦

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310006

人參皂苷對波動性高血糖大鼠腎臟Nrf2及NQO1表達(dá)的影響*

王 丹1黃 琦2#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310006

目的：探討人參皂苷對波動性高血糖大鼠腎臟轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor2，Nr f2)及醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase l，NQO1）表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法：將48只雄性SD大鼠隨機(jī)分成正常對照組（NC組，n=8）和糖尿病模型組（n=40）。高脂飼料喂養(yǎng)糖尿病模型組大鼠2周后用小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，之后隨機(jī)分為穩(wěn)定高糖組（SH組，n=8）和波動性高糖組（FH組，n=32），F(xiàn)H組錯時注射葡萄糖、胰島素制備血糖波動大鼠模型。2周后，將FH組隨機(jī)分為4組，分別是低劑量組（LG組），中劑量組（MG組），高劑量組（HG組）及波動性高糖組（BG組），予人參皂苷低中高劑量（14、28、56mg/(kg·d)）干預(yù)相對應(yīng)的模型組8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后切取腎臟組織，用western blot和RTPCR(Real-time Polymerase Chain Reaction)檢測Nr f2和NQO1蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果：與NC組相比，SH組Nr f2和NQO1的蛋白及mRNA的表達(dá)明顯增加（P＜0.05），與SH組相比，BG組Nr f2和NQO1的蛋白及mRNA的表達(dá)明顯增加（P＜0.05），與BG組相比，人參皂苷治療組Nr f2和NQO1的蛋白及mRNA的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論：人參皂苷能夠進(jìn)一步促進(jìn)波動性高糖狀態(tài)下Nr f2及NQO1蛋白及mRNA表達(dá)，通過增加NQO1的含量，提高機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，保護(hù)波動性高血糖所致的腎臟損傷。

人參皂苷 波動性高血糖 轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2 醌氧化還原酶1 氧化應(yīng)激 大鼠

糖尿病腎臟病變是糖尿病患者常見的慢性微血管并發(fā)癥，近年來研究發(fā)現(xiàn)，血糖波動與糖尿病血管并發(fā)癥有著密切的關(guān)系[1]，可能在糖尿病腎病中發(fā)揮了一定的作用。在生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)可以正常調(diào)節(jié)空腹血糖及餐后血糖，使其維持在正常水平，而糖尿病患者由于胰島素的缺乏或者分泌不足，血糖往往波動較大，與穩(wěn)定性高血糖相比，波動性高血糖對糖尿病患者腎臟的危害性更大[2]，但其導(dǎo)致的糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制尚不明確，但氧化應(yīng)激似乎在腎臟損傷過程中起著重要作用。人參皂苷作為人參的提取物，可抗氧化及清除機(jī)體內(nèi)自由基[3]。因此，它可能在治療糖尿病腎病中起到一定作用。

轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nr f2)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，它通過與應(yīng)答元件(ARE)結(jié)合，激活下游各種細(xì)胞保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄，包括血紅素加氧酶-1（HO-1），NQO1醌氧化還原酶1（NQO1），從而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激損傷作用[4]。研究表明，在糖尿病腎病的發(fā)病過程中，ARE/Nr f2通路的活性會增加[5]。因此，通過上調(diào)ARE/Nr f2信號通路，提高其下游抗氧化應(yīng)激因子的表達(dá)，可能作為治療糖尿病腎病的一種方法。本實(shí)驗(yàn)用人參皂苷對波動性高血糖所致腎臟損傷的大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察腎臟組織中Nr f2和NQO1的蛋白及基因的表達(dá)，旨在探討人參皂苷對波動性高血糖所致的腎臟損傷的治療作用及其保護(hù)機(jī)制，從而為人參皂苷的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器:人參皂苷粉末(浙江省中醫(yī)院自制，制劑批準(zhǔn)號:201308190)；超短效胰島素諾和銳(丹麥諾和銳)；鏈尿佐菌素(Sigma公司)；自制高脂飼料:蔗糖10%、蛋黃10%、豬油10%、膽固醇0.5%、基礎(chǔ)飼料69.5%；NQO1和Nr f2引物(Takara公司)；兔抗NQO1多克隆抗體和兔抗Nr f2多克隆抗體(CST公司)；RT-PCR反應(yīng)試劑盒（TaKaRa公司）；Trizol裂解液（Invit rogen公司）；血糖試紙及血糖儀(德國羅氏)；Step one plus PCR儀（美國生物應(yīng)用系統(tǒng)公司）。

1.2 動物分組及模型制備:6～8周齡SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量160～180g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供[SCXK(滬)2008-0016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心[SYXK(浙)2008-0115]。48只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組（NC組）、穩(wěn)定性高糖組(SH組)、波動性高糖組（BG組）、人參皂苷低劑量組（LG組）、人參皂苷中劑量組（MG組）、人參皂苷高劑量組（HG組），每組8只。除正常對照組使用正常飼料喂養(yǎng)外，其余各組均使用高脂飼料喂養(yǎng)2周后禁食不禁水16小時，用小劑量STZ 35mg/kg腹腔注射誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，造模1周后，禁食不禁水16h，測空腹血糖15～20mmol/L為模型制作成功。NC組給予腹腔注射生理鹽水0.375g/(kg·d)體質(zhì)量作為對照，SH組定時給予腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.375g/(kg·d)。BG組、LG組、MG組、HG組予腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.375g/(kg·d)，錯時30min后給予腹腔注射超短效胰島素類似物諾和銳，造成一天中血糖值大幅度波動模型，使其血糖值在高血糖和低血糖間反復(fù)漂移，注射后30min測血糖，制作波動性高血糖模型，連續(xù)6周，血糖波動幅度＞1SD為有效波動。LG組、MG組、HG組分別予人參皂苷（14、56mg/kg/d）灌胃，BG組予等量生理鹽水灌胃8周作對照，每日2次。

1.3 標(biāo)本采集:每周用血糖儀測尾尖血血糖，稱其體質(zhì)量，并計算水和食物的攝入量。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大鼠禁食12小時，切取腎臟組織，放入液氮罐中保存，用于western blot及RT-PCR檢測。

1.4 western blot檢測NQO1和Nr f2蛋白表達(dá)水平:從液氮罐中取出腎臟組織，放入液氮預(yù)冷過的研缽中，加入蛋白酶抑制劑+裂解液（1∶100）適量，研磨至液體澄清；吸取全部液體放入離心管中，12000rpm，4℃，離心15min，提取細(xì)胞總蛋白；采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度；吸取蛋白樣品，以60V電壓電泳，當(dāng)條帶跑至分離膠和濃縮膠分界面時改為90V電泳，時間2～4h；PVDF轉(zhuǎn)膜（250MA，2.5h）；將PVDE膜浸于封閉液中，4℃封閉過夜；取出膜，與一抗接觸，室溫旋轉(zhuǎn)孵育2～3h，用TBST沖洗3次，同樣的方法二抗室溫孵育1～2h后，TBST洗3次；加入ECL試劑，將PVDF膜放在Chemi Doc XRS上采集圖像。以β-actin表達(dá)水平作為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的對比表示蛋白的表達(dá)量。

1.5 RT-PCR檢測NQO1和Nr f2mRNA表達(dá):由基因庫查的所需mRNA的核苷酸序列，PrimerPremier計算機(jī)軟件輔助引物設(shè)計，引物由TakaRa公司設(shè)計并合成。, Nr f2上下游引物分別為:5’-TGTAGTGCGAGGAAGAGGTATGA-3′和5’-GGAGGGAAAGGAGAGGAAGG-3′，NQO1上下游引物分別為:5’-ATTGTGCTTGTGAGGGTGTTTC-3′和5’-CCCTTCCTGTCTTTTCTTCTCTCT-3′。從液氮中取出腎臟組織冰上迅速研碎后，用Trizol法提取總RNA；吸取1μl抽提的RNA在Nanodropl000上進(jìn)行RNA濃度測定，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測RNA的完整性；取RNA按照逆轉(zhuǎn)錄體系逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；取cDNA 2μl及Nr f2和NQO1上下游引物各0.4μl，SYBRPremix Ex TaqTM（2×）10μl，Rox Reference Dye II（50×）0.4μl，滅菌雙蒸水6.8μl（擴(kuò)增條件為:95℃、5min，94℃、1min，57℃、1min，72℃、1min，32個循環(huán)后，72℃8min。2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后置于Bio-Rad Gel凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描分析，以GAPDH作為內(nèi)參照，用目的基因的吸光度與GAPDH吸光度的比值分析目的基因的相對表達(dá)水平。）

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，多樣本均數(shù)的兩兩比較采用單因素方差分析，如果方差齊采用LSD，方差不齊采用Tamhane＇sT2。以P＜0.05差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷對Nr f2和NQO1蛋白的表達(dá):Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，SH組NQO1和Nr f2蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）；與SH組相比，BG組NQO1和Nr f2蛋白表達(dá)均明顯增高（P＜0.05）；與BG組相比，LG、MG、HG組NQO1和Nr f2蛋白表達(dá)均明顯增高（P＜0.05），且隨著人參皂苷濃度的增加，低、中、高劑量組NQO1及Nr f2蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。(圖1～2)

圖1 各組大鼠腎臟Nr f2及NQO1蛋白的表達(dá)

圖2 各組大鼠腎臟Nr f2及NQO1蛋白的表達(dá)量

2.2 人參皂苷對NQO1和Nr f2 mRNA的表達(dá):RT-PCR結(jié)果顯示，與NC組相比，SH組NQO1和Nr f2 mRNA表達(dá)增高（P＜0.05）；與SH組相比，BG組NQO1和Nr f2 mRNA表達(dá)均明顯增高（P＜0.05）；與BG組相比，LG、MG、HG組NQO1和Nr f2 mRNA表達(dá)均明顯增高（P＜0.05），且隨著人參皂苷濃度的增加，低、中、高劑量組NQO1及Nr f2 mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠腎臟NQO1及Nr f2基因的表達(dá)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SH組及BG組Nr f2和NQO1蛋白及mRNA表達(dá)明顯高于NC組，但BG組Nr f2和NQO1蛋白及mRNA表達(dá)明顯高于SH組，說明在生理狀態(tài)下，其表達(dá)量較低，但在引起氧化應(yīng)激的因素誘導(dǎo)下如高血糖可誘導(dǎo)其顯著表達(dá)。雖然血糖升高刺激Nr f2和NQO1蛋白及mRNA表達(dá)增加，但其并不能對抗氧化應(yīng)激對波動性高血糖大鼠腎臟的損傷。較穩(wěn)定性高血糖，波動性高血糖的慢性并發(fā)癥的發(fā)病率更高，而且出現(xiàn)的時間越早，慢性并發(fā)癥越高，這與氧化應(yīng)激對機(jī)體的損傷的增加有著密切的關(guān)系。

人參素有“百草之王”“神草”等稱號，《神農(nóng)本草經(jīng)》把人參列為上品，味甘，微寒，“主補(bǔ)五臟、安精神、止驚悸、除邪氣、明目、開心益智、久服輕身延年”功效。人參作為補(bǔ)虛中藥的第一要藥，治療“消渴”早有記載。《傷寒論》第222條記載，“渴欲飲水，口干舌燥者，白虎加人參湯主之”。糖尿病屬“消渴”范疇，其病機(jī)主要在于陰精虧虛，燥熱偏勝，故以清熱潤燥、養(yǎng)陰生津?yàn)橹委煷蠓ā，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，人參皂苷是其主要活性成分，具有抗氧化、清除自由基、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、提高免疫力、降血糖等作用[6-8]。在該實(shí)驗(yàn)中，人參皂苷有效上調(diào)了大鼠腎臟內(nèi)Nr f2和NQO1的表達(dá)。Nr f2被認(rèn)為在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的抗氧化應(yīng)激作用，當(dāng)受到外界氧化刺激時，Nr f2從Keap-1中解離，通過與ARE結(jié)合，并參與下游II相代謝酶基因和抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)NQO1的表達(dá)[9]。Nr f2的激活可以誘導(dǎo)NQO1的表達(dá)，抗氧化蛋白含量增加，提高了機(jī)體的抗氧化反應(yīng)能力。

綜上所述，NQO1是細(xì)胞內(nèi)的一種保護(hù)性還原酶，可減少外界物質(zhì)對細(xì)胞的氧化損傷，本文研究顯示人參皂苷可通過上調(diào)Nr f2和NQO1基因和蛋白的表達(dá)，減緩波動性高糖所致氧化應(yīng)激對腎臟功能的損害，其機(jī)制可能是通過激動Nr f2/ARE信號通路啟動該抗氧化蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在臨床上，現(xiàn)有的治療及研究很難從根源上徹底逆轉(zhuǎn)胰島β細(xì)胞功能的障礙和凋亡，而作為傳統(tǒng)中藥人參的提取物，人參皂苷發(fā)揮了其自身優(yōu)勢，為應(yīng)用于糖尿病腎臟病變的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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2016-07-06

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項(xiàng)目人參皂苷通過Nr f2/ARE信號通路干預(yù)波動性高糖致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究，編號：2014ZA045

# 通訊作者：黃 琦，E-mail：hq871201@163.com