FGF21對H9C2心肌細胞H/R損傷及Angpt2、GLUT1表達的影響

胡碩強+曹樹軍++韓蘭唐++邢成偉++謝剛++柳景華

[摘要] 目的 探討FGF21對H9C2心肌細胞缺氧/復氧（H/R）損傷及Angpt2、GLUT1表達的影響。方法 體外培養H9C2心肌細胞并分為H9C2組、H/R組、H/R+FGF21組，H9C2組即H9C2細胞陰性對照組，H/R組給予缺氧6 h/復氧24 h處理，H/R+FGF21組則在細胞復氧時給予FGF21（1 μg/mL）處理。利用FCM檢測各組細胞凋亡率，QPCR及Western blot檢測各組Angpt2、GLUT1、Caspase-3的表達水平。 結果 H/R組細胞凋亡率顯著高于H9C2組（P < 0.01）。與H/R組比較，H/R+FGF21組細胞凋亡率顯著降低（P < 0.01）。QPCR及Western blot檢測發現，與H9C2組比較，H/R組Angpt2、Caspase-3表達顯著增加，GLUT1表達顯著降低（P < 0.01）；與H/R組比較，H/R+FGF21組Angpt2、Caspase-3表達顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），GLUT1表達顯著增加（P < 0.05）。 結論 外源性FGF21可顯著減輕H/R損傷所致H9C2細胞凋亡，抑制炎癥因子Angpt2表達和增加GLUT1表達可能是其內在機制。

[關鍵詞] FGF21；H9C2細胞；缺氧/復氧損傷；Angpt2；凋亡

[中圖分類號] R542.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0032-05

再灌注治療是改善急性心肌梗死患者預后的根本措施，其在增加供血、挽救瀕死心肌之外，也會引起無復流、心肌細胞凋亡和壞死、再灌注心律失常、心功能惡化等，稱之為缺血/再灌注（I/R）損傷。心肌I/R損傷是患者心功能惡化和不良預后的主要原因，其機制復雜，涉及心肌細胞凋亡、能量代謝障礙、炎癥損傷等。成纖維細胞生長因子（FGF）21是一種內分泌型FGF，具有抗氧化應激、抗炎、改善能量代謝、抑制心肌凋亡等心血管保護作用[1]，但其內在機制仍不完全清楚。

葡萄糖轉運體（GLUT）1是調節心肌細胞有氧糖代謝的關鍵步驟，是一種內源性保護因子。血管生成素2（Angpt2）是血管生成素家族中最為重要的成員之一，Angpt2作為一種炎癥因子參與了多種病理生理過程包括感染性休克、急性心肌梗死、同種異體心臟移植I/R損傷、移植心臟血管病等[2-3]。本研究利用H9C2細胞缺氧/復氧（H/R）損傷模型模擬心肌I/R損傷，旨在探討外源性FGF21（rhFGF21）對H9C2心肌細胞H/R損傷的保護作用及對Angpt2和GLUT1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 H9C2細胞購買于ATCC（CRL-1446）。

1.1.2 主要試劑 rhFGF21（美國ABNOVA，P5989，純度> 95%）；DMEM-高糖培養基（Hyclone，Cat.No.SH30022.01B）；胎牛血清（Gibco，Cat.No.10099-141）；Annexin V/PI apoptosis kit（聯科生物，AP101）；Trizol（TAKARA公司產品）；RT-PCR試劑（DBI公司產品）；RNasin（美國Promega公司產品）等。

1.1.3 實驗儀器 低速離心機（Anke/飛鴿，TDL-80-2B）；CO2細胞培養箱（Memmer，INC108）；缺氧復氧培養箱（SANYO三洋，MCO-5M）；倒置顯微鏡（MOTIC）；流式細胞儀（BD，FACSCalibur）；酶聯免疫監測儀（Thermo Fisher Scientific，multiscan MK3）；Real Time PCR儀（美國Agilent公司）；SDS-PAGE垂直電泳槽（北京凱元伯樂生物科技有限公司）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 H9C2細胞H/R模型建立 將H9C2細胞接種于60 mm培養皿中，培養環境為37℃，5%CO2。當細胞密度> 90%時，用于后續實驗。10% FBS的DMEM培養基更換為PBS，在缺氧復氧培養箱充入95% N2 10 min后，把缺氧復氧培養箱放入37℃的恒溫培養箱中進行缺氧（O2含量約為2%）6 h，然后去掉PBS，重新加入含10% DMEM的培養基，置于37℃，20% O2， 5%CO2中繼續培養24 h（即缺氧6 h/復氧24 h）。

1.2.2 給藥方法 在細胞復氧時給予rhFGF21治療，rhFGF21凍干粉直接配置于再灌注液（含10% DMEM的培養基）中，濃度為1 μg/mL，為防止其降解，現配現用，藥液不做保存。

1.2.3 實驗分組 實驗分三組：H9C2組、H/R組、H/R+FGF21組。H9C2組即H9C2細胞陰性對照組，H/R組給予缺氧6 h/復氧24 h處理，FGF21組則在細胞復氧時給予FGF21（1 μg/mL）處理。

1.2.4 檢測指標 利用流式細胞儀（FCM）檢測各組H9C2細胞凋亡率，利用QPCR及Western blot檢測各組H9C2細胞Angpt2、GLUT1、Caspase-3的表達。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗；方差不齊進行Kruskal-Wallis H檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡情況比較

H9C2組細胞凋亡率為（9.17±1.12）%（圖1A）；H/R組細胞凋亡率為（38.87±3.71）%（圖1B）；H/R+FGF21組細胞凋亡率為（24.80±1.95）%（圖1C）；H/R組細胞凋亡率顯著高于H9C2組（P < 0.01），H/R+FGF21組細胞凋亡率顯著低于H/R組（P < 0.01）（圖1D）；表明H9C2心肌細胞H/R損傷模型建立成功，FGF21干預可以顯著抑制H/R損傷所致H9C2細胞凋亡。

2.2 各組Angpt2、GLUT1、Caspase-3 mRNA表達情況比較

與H9C2組比較，H/R組Angpt2 mRNA表達顯著升高（P < 0.01，圖2A），GLUT1 mRNA表達顯著降低（P < 0.01，圖2B），Caspase-3 mRNA表達顯著升高（P < 0.01，圖2C）；與H/R組比較，H/R+FGF21組Angpt2 mRNA表達顯著降低（P < 0.01，圖2A），GLUT1 mRNA表達升高（P < 0.05，圖2B），Caspase-3 mRNA表達降低（P < 0.05，圖2C）。

2.3 各組Angpt2、GLUT1、Caspase-3蛋白表達情況比較

H9C2組、H/R組、H/R+FGF21組細胞中Angpt2和Caspase-3的表達趨勢相似，均為H/R組 > H/R+FGF21組 > H9C2組；GLUT1的表達水平由低到高依次為H/R組 < H/R+FGF21組 < H9C2組。圖3。

3 討論

細胞凋亡在心肌I/R損傷的病理生理過程中起重要作用。心肌I/R損傷通過多種機制誘導心肌細胞凋亡，比如能量代謝障礙、氧自由基增多、細胞內鈣超載、線粒體損傷、炎癥損傷等。本研究發現，H/R組細胞凋亡率顯著高于H9C2組，表明H9C2心肌細胞H/R損傷模型建立成功；在細胞復氧同時給予rhFGF21（1 μg/mL）處理可以顯著抑制細胞凋亡、提高存活率，表明外源性FGF21具有抗凋亡等心肌保護作用。已知細胞凋亡的途徑有死亡受體介導途徑、線粒體介導途徑和內質網介導途徑等， Caspase在各種途徑介導的細胞凋亡中起著核心作用，是細胞凋亡激活的必由之路，Caspase-3處于細胞凋亡信號通路的下游，是凋亡通路中的重要信號分子，Caspase-3斷裂激活能直接水解底物，包括細胞質和細胞核內與DNA修復、復制，RNA剪切和細胞骨架等相關的蛋白質，并導致細胞凋亡。因此Caspase-3常作為細胞凋亡的檢測指標。本研究利用QPCR和Western blot檢測Caspase-3表達，結果顯示，H/R損傷誘導Caspase-3表達顯著增加；給予rhFGF21處理后能顯著抑制Caspase-3表達，說明rhFGF21可以通過某些通路抑制Caspase-3的斷裂激活，從而抑制細胞凋亡。

FGF21是近年來新發現的一種FGF，屬于FGF家族（FGFs），主要由肝臟、脂肪組織、胰腺、骨骼肌等分泌，作為一種內分泌激素調節糖脂代謝，增加胰島素敏感性，保護胰島β細胞功能，降低體重和改善肝脂肪變性等，且無增殖、低血糖、水腫等副作用，有望成為一種新的降糖、調脂和治療肥胖的藥物。GLUT是細胞膜上的一種跨膜糖蛋白，負責葡萄糖跨膜轉運，在心肌中表達的GLUT形式主要有GLUT1和GLUT4。心肌缺血時位于細胞器膜的GLUT1和保存于囊泡內的GLUT4迅速轉移到細胞漿膜，使心肌細胞攝取更多的葡萄糖以代償缺血心肌能量利用失衡。GLUT1是FGF21作用底物之一，GLUT1是心肌細胞攝取葡萄糖的限速步驟，現已知增加心肌細胞葡萄糖攝取和糖酵解代謝可以抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡。本研究初步探討了GLUT1在心肌細胞H/R損傷中的改變及rhFGF21干預對其的影響。本研究利用QPCR和Western blot檢測發現H/R抑制心肌細胞GLUT1表達，而給予rhFGF21處理可顯著增加GLUT1表達。目前認為GLUT1在心肌缺血、缺氧時可作為一種內源性保護因子[4-6]。FGF21上調H9C2細胞GLUT1表達可能通過以下機制發揮心肌保護作用：①GLUT1表達增加將增加心肌細胞復氧時對葡萄糖的攝取，抑制脂肪酸氧化，優化細胞能量代謝[7]；②GLUT1作為缺氧誘導因子（HIF-1α）、Akt下游靶基因，推測FGF21通過Akt-GLUT1-cJNK途徑抑制凋亡等[4，7]；③通過激活線粒體ATP敏感性鉀通道，維持心肌細胞和線粒體膜穩定性，保護線粒體功能，減少再灌注心律失常等[8]。

此外，炎癥在I/R損傷和細胞凋亡的發生、發展中也起重要作用，心肌I/R時可刺激血管內皮細胞和心肌細胞等表達和分泌炎癥介質或細胞因子，比如TNF-α、ICAM-1、IL-6、VEGF等，引起白細胞黏附、聚集和激活，導致細胞組織損傷和無復流等微循環障礙。基礎研究也發現，FGF21可通過抗炎、促血管生成等機制發揮抗I/R損傷等心血管保護作用，但其內在機制并不完全清楚。近年來，兼有促血管生成和致炎作用的Angpt2在心肌I/R損傷中的作用日益引起重視[2]，已有學者將其作為判斷病情嚴重性與預后的一種新型標志物和炎癥分子[9-12]。多數研究提示，在心肌I/R損傷時Angpt2表達增加并發揮促凋亡作用[13-16]。本研究首次探討了H9C2心肌細胞H/R損傷及rhFGF21干預對Angpt2表達的影響。研究發現，H9C2心肌細胞H/R損傷可以顯著增加Angpt2表達，而FGF21減輕H/R損傷同時顯著抑制Angpt2表達，提示抑制Angpt2表達可能是FGF21抗凋亡的心肌保護機制之一。但目前Angpt2促凋亡機制并不清楚，有待進一步研究揭示。

目前文獻報道涉及FGF21抗心肌凋亡作用的細胞內傳導途徑和機制主要有以下幾個方面：①FGF21可以內分泌激素形式作用于心肌，通過激活FGFR1/β-Klotho-PI3K-Akt1-BAD細胞內信號網絡，最終抑制Caspase-3活性而減少心肌細胞凋亡[17-18]；②外源性FGF21通過Akt-GSK-3β-Caspase-3依賴的信號轉導途徑減輕H9C2細胞I/R損傷，減輕氧化應激、改善能量代謝，抑制TNF-α和PAI-1等炎癥因子表達[19]；③骨骼肌來源的FGF21可以脂聯素依賴方式顯著減輕鼠心肌梗死，改善心功能，減少心肌細胞凋亡，促進血管生成及抑制炎癥因子釋放等[20]。

總之，外源性FGF21可通過上調GLUT1表達改善細胞能量代謝，以及下調促炎因子Angpt2表達等機制，顯著減輕H/R損傷所致H9C2細胞凋亡，具有抗心肌I/R損傷的有益作用。

[參考文獻]

[1] Tanajak P，Chattipakorn SC，Chattipakorn N. Effects of fibroblast growth factor 21 on the heart [J]. J Endocrinol，2015，227（2）：R13-R30.

[2] Scholz A，Plate KH，Reiss Y. Angiopoietin-2：a multifaceted cytokine that functions in both angiogenesis and inflammation [J]. Ann N Y Acad Sci，2015，1347：45-51.

[3] Ziegler T，Horstkotte J，Schwab C，et al. Angiopoietin 2 mediates microvascular and hemodynamic alterations in sepsis [J]. J Clin Invest，2013，123（8）：3436-3445.

[4] Hyv？覿rinen J，Hassinen IE，Sormunen R，et al. Hearts of hypoxia-inducible factor prolyl 4-hydroxylase-2 hypomorphic mice show protection against acute ischemia-reperfusion injury [J]. J Biol Chem，2010，285（18）：13646-13657.

[5] Lin Z，Weinberg JM，Malhotra R，et al. GLUT-1 reduces hypoxia-induced apoptosis and JNK pathway activation [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2000，278（5）：E958-E966.

[6] Morissette MR，Howes AL，Zhang T，et al. Upregulation of GLUT1 expression is necessary for hypertrophy and survival of neonatal rat cardiomyocytes [J]. J Mol Cell Cardiol，2003，35（10）：1217-1227.

[7] Luptak I，Yan J，Cui L，et al. Long-term effects of increased glucose entry on mouse hearts during normal aging and ischemic stress [J]. Circulation，2007，116（8）：901-909.

[8] Pereira RO，Wende AR，Olsen C，et al. Inducible overexpression of GLUT1 prevents mitochondrial dysfunction and attenuates structural remodeling in pressure overload but does not prevent left ventricular dysfunction [J]. J Am Heart Assoc，2013，2（5）：e000301.

[9] Bhandari V，Choo-Wing R，Lee CG，et al. Hyperoxia causes angiopoietin 2-mediated acute lung injury and necrotic cell death [J]. Nat Med，2006，12：1286-1293.

[10] Ziegler T，Horstkotte J，Schwab C，et al. Angiopoietin 2 mediates microvascular and hemodynamic alterations in sepsis [J]. J Clin Invest，2013，123（8）：3436-3445.

[11] Wang X，Yong H，Mi L，et al. Changes and significance of serum angiopoietin-2 levels in patients with coronary heart disease [J]. Biomarkers，2012，17（8）：745-749.

[12] Patel JV，Lim HS，Varughese GI，et al. Angiopoietin-2 levels as a biomarker of cardiovascular risk in patients with hypertension [J]. Ann Med，2008，40（3）：215-222.

[13] Ray PS，Estrada-Hernandez T，Sasaki H，et al. Early effects of hypoxia /reoxygenation on VEGF，Ang-1，Ang-2 and their receptors in the rat myocardium：implications for myocardial angiogenesis [J]. Mol Cell Biochem，2000， 213（1-2）：145-153.

[14] Shyu KG，Chang CC，Wang BW，et al. Increased expression of angiopoietin-2 and Tie2 receptor in a rat model of myocardial ischaemia/reperfusion [J]. Clin Sci（Lond），2003，105（3）：287-294.

[15] Sandhu R，Teichert-Kuliszewska K，Nag S，et al. Reciprocal regulation of angiopoietin-1 and angiopoietin-2 following myocardial infarction in the rat [J]. Cardiovasc Res，2004，64（1）：115-124.

[16] Zhou L，Zang G，Zhang G，et al. MicroRNA and mRNA signatures in ischemia reperfusion injury in heart transplantation [J]. PLoS One，2013，8（11）：e79805.

[17] Liu SQ，Tefft BJ，Roberts DT，et al. Cardioprotective proteins upregulated in the liver in response to experimental myocardial ischemia [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，303（12）：H1446-H1458.

[18] Liu SQ，Roberts D，Kharitonenkov A，et al. Endocrine protection of ischemic myocardium by FGF21 from the liver and adipose tissue [J]. Sci Rep，2013，3：2767.

[19] Cong WT，Ling J，Tian HS，et al. Proteomic study on the protective mechanism of fibroblast growth factor 21 to ischemia-reperfusion injury [J]. Can J Physiol Pharmacol，2013，91（11）：973-984.

[20] Joki Y，Ohashi K，Yuasa D，et al. FGF21 attenuates pathological myocardial remodeling following myocardial infarction through the adiponectin-dependent mechanism [J]. Biochem Biophys Res Commun，2015，459（1）：124-130.

（收稿日期：2016-10-29 本文編輯：李亞聰）