胰島素通過Erk通路促進人乳腺癌細胞MCF—7增殖和遷移

孟敏君

[摘要]目的觀察胰島素對人乳腺癌細胞MCF-7中Erk信號通路的影響及其對MCF-7細胞增殖、侵襲和遷移的影響。方法分別采用0、50、100和200nM不同劑量的胰島素處理MCF7細胞0、24、48和72h，采用Western blot方法檢測MCF-7細胞中Erk信號通路的磷酸化活化情況，采用MTT方法檢測MCF-7細胞的增殖情況。通過傷口愈合實驗和Boyden小室檢測200nM胰島素處理72h對MCF-7細胞侵襲和遷移能力的影響。采用Erk信號通路抑制劑預處理MCF-7細胞，觀察Erk信號通路在胰島素促MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲能力中的作用。結果同0nM胰島素處理組相比，不同劑量的胰島素均可顯著上調Erk的磷酸化水平，加強MCF-7細胞的增殖能力（P<0.05），且這種作用具有計量依賴性。同對照組相比，200nM胰島素處理72h后，MCF-7細胞侵襲和遷移能力均顯著增強（f=188.000、95.640，P<0.05）。采用Erk信號通路阻斷劑U0126阻斷MCF-7細胞中的Erk信號通路后，胰島素促MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲的能力顯著降低（P<0.05）。結論胰島素可通過激活MCF-7細胞中的Erk信號通路，增強腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

[關鍵詞]胰島素；乳腺癌；MCF-7；增殖；遷移

[中圖分類號]R737.9

[文獻標識碼]B

[文章編號]2095-0616（2016）23-33-06

胰島素可與胰島素樣生長因子-1受體（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）和胰島素受體（insulin receptor，IR）及向下游傳遞活化信號，進而促進細胞的有絲分裂，胰島素的這一作用促使研究者們猜想其與腫瘤的發生發展是密不可分的。研究結果證實，高胰島素血癥、2型糖尿病以及肥胖等代謝相關性疾病可導致腫瘤的發病風險顯著升高。目前女性乳腺癌的發病率已成為女性惡性腫瘤中發病率最高的一種，而胰島素作為一種生長因子，其在女性乳腺癌發病中的作用也得到相關文獻的證實。而目前關于胰島素參與乳腺癌發生發展中的機制研究仍需要更深層次地探索。據此，本研究期待通過觀察胰島素對人乳腺癌細胞MCF-7中Erk信號通路活化情況的影響及其對MCF-7細胞增殖、侵襲和遷移的影響，初步探討胰島素參與乳腺癌發生發展的機制。結果如下。

1.材料與方法

1.1細胞及試劑

首先由取中國醫學科學院基礎醫學研究所提供的人乳腺癌細胞株MCF7，然后采用DMEM培養基（含胎牛血清，濃度為10%）對其進行培養。一抗為鼠抗人p-Erk抗體，由深圳晶美生物科技有限公司提供；羊抗兔和羊抗鼠IgG（由辣根過氧化物酶標記）均購自Bio-Rad公司；Erk信號通路抑制劑、蛋白酶、CytoBuster蛋白、磷酸酶抑制劑購自Thermo公司；Boyden小室（用作侵襲實驗）購自美國Millipore公司。

1.2研究方法

1.2.1細胞處理方法分別采用不同濃度的胰島素對受試細胞分別處理0、24、48和72h，其中胰島素濃度分別為0、50、100和200nM。

1.2.2細胞總蛋白提取首先利用冰PBS對待檢細胞連續兩次洗滌，然后實施離心分離處理，離心加速度和時間分別設置為400×g、5min；處理完成后在沉淀中依次加入蛋白酶、磷酸酶抑制劑，然后加入CytoBuster蛋白，劑量為100uL，將所得實際混合均勻后于25℃條件下孵育處理15min；再次行離心分離處理，離心加速度和時間分別設置為12000×g、15min，溫度為4°C。取上清液對蛋白濃度進行檢測，另取部分上清液分裝15uL，保存于-80℃恒溫冰箱中。

1.2.3蛋白濃度測定首先采用BCA法測定：對標準品進行稀釋處理，并按照50：1的體積比混合完成工作液的配置，在96孔板中分別加入200uL的標準工作液，并加入25uL待測樣品或者標準品，每個待測標本均需要設置3個復孔。在37°C的條件下完成時長為30min的孵育處理，測定OD值后根據標準品所得結果繪制標準曲線圖，并據此推算出待測樣品的水平。采用Western blot測定：將提取的蛋白經SDS-PAGE（濃度為8%-10%）和濃縮膠（濃度為5%）進行分離處理，待樣品半干后需要將其轉印到硝酸纖維素膜，并加入BSA（濃度為5%）進行時長為2h的封閉孵育，加入一抗后在4℃條件下孵育，時長為12h。次日采用TBST（濃度為0.1%）的溶液對膜片反復3次沖洗，每次沖洗時長均為5min。在待測樣品中添加相應標記二二抗，25℃條件下進行時長為1h的封閉孵育。完成后采用TBST（濃度為0.1%）的溶液沖洗膜片，并利用深圳晶美生物科技有限公司提供的敏感化學發光底物處理條帶，以便顯色。內參為Actin，判讀結果。

1.2.4細胞增殖能力檢測利用MTT方法：首先需要將處于良好的對數生長期的細胞接種，并分別采用不同濃度的胰島素滴入接種板孔中，孵育不同時間。完成操作后均加入MTT溶液20uL，等待4h，將上清液徹底吸出后加入DMSO溶液15020uL，低速震蕩處理，時長為10min，測定OD值（490nm波長位置）。

1.2.5遷移和侵襲強度檢測采用傷口愈合實驗方法：參照文獻操作。將待檢細胞首先采用臺盼藍染色計數處理，然后實施重懸干預，取1×105個細胞于Boyden小室的上層，添加培養基直至整個體系為300uL，取500uL胎牛血清培養基（濃度為10%）于Boyden小室下層，上層和下層樣品均孵育12h，利用棉拭子將未出現侵襲的細胞除去，取結晶紫（濃度為0.1%）對下層細胞實施固定染色處理，計算侵襲強度。最后，向含有待檢樣品的培養基中加入Erk信號通路阻斷劑，劑量為U0126 10umol/L，觀察并評估阻斷情況。

1.3觀察指標

觀察Western blot法測定不同濃度和時間下胰島素對MCF-7細胞增殖的影響，包括0、24、48和72h時0、50、100和200nM濃度下胰島素間A值變化；觀察MMT法測得不同濃度和時間下胰島素對MCF-7增殖指數的影響；對比胰島素對MCF-7細胞遷移和侵襲能力中的作用；比較不同處理方式下A值、細胞增殖指數、侵襲細胞數、切口寬度百分比數據。

1.4統計學分析

采用SPSSl6.0軟件，計量資料以（x±s）描述量形式的數據，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1Western blot法測定不同濃度和時間下胰島素對MCF-7細胞增殖的影響

每兩個時刻和每兩個濃度間A值比較差異均有統計學意義（P<0.05），其中A值隨著時間的延長和濃度的增高均不斷增加，見表1～3、圖1。

2.2MMT法測得不同濃度和時間下胰島素對MCF-7增殖指數的影響

每兩個時刻和每兩個濃度間細胞MCF-7增殖指數比較差異均有統計學意義（P<0.05），隨著時間的延長和濃度的增加，細胞增殖指數水平均不斷升高，見表4、圖2。

2.3胰島素對McF-7細胞遷移和侵襲能力中的作用

對照組與胰島素組72h后轉移細胞數和侵襲細胞數均較0h明顯增多（P<0.05），且72h胰島素組轉移和侵襲細胞數均較對照組顯著增多（P<0.05），見表5、圖3。

2.4不同處理方式TA值、細胞增殖指數、侵襲細胞數、切口寬度百分比比較

對照組、胰島素組、胰島素+U0126組A值、細胞增殖指數、侵襲細胞數、切口寬度百分比兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表6、圖4。

3.討論

乳腺癌在全世界范圍內的發生率均呈現出大幅增長的態勢，盡管我國的發病率較低，但是增長

態勢相對來說也比較明顯。據相關資料顯示，女性乳腺癌發病率在我國范圍內已經躍居女性癌癥的第1位。可知該病形勢嚴峻，已經成為當前重大的公共衛生問題。但是此類病例的病因病機尚未完全清楚。近年來相關研究通過對乳腺癌病例進行調查發現其中存在明顯的規律性，也基本明確了該病的高危因素。近年來的研究結果顯示，胰島素可能與多種腫瘤的發生發展密切相關，提示胰島素可能也會作為一種致病因素參與乳腺癌的發生和發展。

胰島素作為一種多功能的蛋白質激素，除外可調節人體代謝，還可通過調節細胞有絲分裂促進細胞生長。本研究發現以0、50、100和200nM的胰島素及200nM的胰島素處理MCF7細胞O、24.48和72h，MCF7細胞的增殖能力明顯增強（P<0.05），與之前報道的胰島素通過有絲分裂促進細胞生長相一致。此外，本研究還證實，以200nM的胰島素處理MCF-7細胞72h，MCF-7細胞的遷移和侵襲能力均顯著升高（P<0.05）。據此，上訴研究結果提示，胰島素可對乳腺癌病例腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移均起到巨大的推動作用，進而增加機體乳腺癌發生和惡化的風險。

胰島素促細胞生長機制方面，Zhang等認為，胰島素可通過激活P13K信號通路，從而刺激肝星狀細胞增殖。此外還有研究認為胰島素可對胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor-1，IGF）受體的表達產生誘導，進而刺激軟骨細胞增殖。胰島素作為一種生長因子在乳腺癌發生發展中的作用已日益得到肯定。而關于胰島素在乳腺癌發生和惡化過程中的機制尚未完全清楚。細胞外信號調節激酶1/2（extracellular-sigual regulated kinase 1/2，ERKl/2）是機體必不可少的物質，屬于MAPK家族成員，一旦生長因子、激素與神經遞質受體結合可以激活該物質的磷酸化，促使活化的因子進入細胞核，進而參與細胞的增殖和分化。另有資料顯示，采用Erk信號通路抑制劑U0126預處理MCF-7細胞后，再以200nM的胰島素處理MCF-7細胞72h，癌細胞增殖、遷移和侵襲能力則被顯著抑制（P<0.01），提示胰島素不僅參與乳腺癌的發生，同時還可增強其增殖、侵襲及轉移強度，導致其預后更為惡化。

本研究結果中，每兩個時刻和每兩個濃度間A值比較差異均有統計學意義（P<0.05），其中A值隨著時間的延長和濃度的增高均不斷增加，說明不同隨著時間的延長和胰島素濃度的升高，MCF-7細胞中Erk信號通路則被顯著阻斷；每兩個時刻和每兩個濃度間細胞MCF-7增殖指數比較差異均有統計學意義（P<0.05），隨著時間的延長和濃度的增加，細胞增殖指數水平均不斷升高，且對照組與胰島素組72h后轉移細胞數和侵襲細胞數均較0h明顯增多（P<0.05），且72h胰島素組轉移和侵襲細胞數均較對照組顯著增多（P<0.05），則說明經過Erk信號通路抑制劑U0126預處理MCF-7細胞后，乳腺癌惡性腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移強度則被顯著抑制；最后對照組、胰島素組、胰島素+U0126組A值、細胞增殖指數、侵襲細胞數、切口寬度百分比兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），證實胰島素不僅在乳腺癌的發展中有重要作用，也能顯著增強其轉移和侵襲能力，而加用Erk信號通路抑制劑U0126后可顯著抑制乳腺癌細胞的增殖、轉移和侵襲作用，與上述研究結論相符合。

綜上所述，胰島素可激活MCF-7細胞中的Erk信號通路，提升其增殖、侵襲及轉移強度。然而是否還存在其他的信號通路參與調控胰島素的促MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲能力還有待進一步的深入研究。