沙門菌屬stn基因LAMP在食品檢驗(yàn)中的有效利用

仇紅萍

沙門菌能夠引起嚴(yán)重的食物中毒，是一種人畜共患的病原菌，該類型細(xì)菌的疫病爆發(fā)以及流行已經(jīng)受到了人類廣泛的關(guān)注，針對(duì)沙門菌的檢驗(yàn)方式更為先進(jìn)，操作也更為簡便。傳統(tǒng)的檢測方式一般以分離培養(yǎng)為主，結(jié)果較為準(zhǔn)確，但是操作步驟繁瑣，而且免疫學(xué)的敏感度較低，生物學(xué)的聚合酶鏈反應(yīng)（簡稱PCR）等敏感度較高，但需要更為先進(jìn)的設(shè)備，因此很難得到大范圍推廣應(yīng)用。LAMP，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，采用新型的方式對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，操作簡單、特異性強(qiáng)，相對(duì)于其它方式，效果十分顯著。

材料與方法

一般材料

2016年7至9月選擇125份食品樣本，包括冷凍生肉16份，生鮮肉16份，熟肉16份，非發(fā)酵類豆制品16份，米面16份，生水產(chǎn)品9份，冰淇淋9份，蔬菜沙拉9份，新鮮果汁9份，生食蔬菜9份。

陽性控制菌株：腸炎沙門菌。

檢測方式

樣本前增菌。根據(jù)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，取25克標(biāo)本，添加到無菌均質(zhì)袋里，均勻拍打兩分鐘，在37℃的條件下培養(yǎng)8至10小時(shí)。冷凍產(chǎn)品需要在45℃下進(jìn)行不超過15分鐘的解凍。

分離培養(yǎng)法。輕柔晃動(dòng)樣本前增菌液，然后從增菌后的290份樣本中選取1毫升，將其放入10毫升TTB增菌液中，在42℃下培養(yǎng)18至24小時(shí)。另外，再取1毫升放置于10毫升SC增菌液中，在37℃下培養(yǎng)18至14小時(shí)。再取1毫升食品標(biāo)準(zhǔn)增菌液，接種在BS平板以及XLD平板上，在37℃下培養(yǎng)18至24小時(shí)。選取3個(gè)可疑的菌落，分別接種在TSI、賴氨酸脫羥酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、瓊脂平板上，在37℃下培養(yǎng)18至24小時(shí)。一定時(shí)間的生化反應(yīng)后，選取其中與沙門氏菌基本符合的，基于瓊脂平板上獲取可疑的菌落，與生理鹽水混合制備成渾濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙海梦⑸锵到y(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)鑒定。若BS與XLD平板上沒有出現(xiàn)可疑菌落，則將BS平板繼續(xù)置于37℃的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)18至24小時(shí)。若結(jié)果仍然沒有可疑菌落，則判定為陰性。若實(shí)際情況需要，可以進(jìn)行血清學(xué)分型。

LAMP檢測方式。獲取食品標(biāo)本前增菌液1毫升，以每分鐘10000r的速率進(jìn)行離心，兩分鐘后停止，將上清液去除，利用核算提取試劑盒將下層核算取出。同時(shí)，另外取出1微升上清液，將待驗(yàn)?zāi)０錎NA制作出來。根據(jù)沙門氏菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)出引物，檢驗(yàn)125份標(biāo)本的DNA，將標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系作為判斷指標(biāo)。在65℃條件、80℃滅活酶下，持續(xù)60分鐘的水浴。反應(yīng)結(jié)束后，觀察反應(yīng)液，如顏色呈現(xiàn)綠色，則為陽性，若為無色或棕色，則為陰性。鑒定方式還可以采用電泳方式，陽性為最小片段大于100bp的特征性梯狀。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方式

利用SPSS15.0軟件幫助分析，計(jì)數(shù)資料利用χ2檢驗(yàn)，差異用P<0.05表示。

結(jié)果分析

經(jīng)過檢驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比分析，LAMP的陽性率為11.2%，分離培養(yǎng)法為5.6%，該比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。如表1：

討論

沙門菌具有多種類型，能夠?qū)θ恕⒓倚蟆⒁吧莴F等產(chǎn)生不同形式的感染。感染沙門菌的人以及帶菌者的糞便如果對(duì)食品造成污染，就會(huì)引起嚴(yán)重的事物中毒現(xiàn)象。沙門氏菌在能夠引起食物中毒的細(xì)菌中常列榜首。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，簡稱LAMP，采用新型方式對(duì)核算進(jìn)行擴(kuò)增，在靶基因的六個(gè)區(qū)域內(nèi)，設(shè)置四種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶的幫助下，將65℃保持30至60分鐘，完成擴(kuò)增。相較于常規(guī)的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），模板無需進(jìn)行熱變形、溫度循環(huán)等過程，因此操作程序簡化了許多，也能快速得到結(jié)果，特異性也比較強(qiáng)。LAMP的靈敏度也比PCR高，檢測范圍也得到了一定的擴(kuò)寬，檢測結(jié)果用肉眼即可觀察到，在食品檢測中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。陸續(xù)有專家對(duì)LAMP檢測方式進(jìn)行了一系列探討。袁發(fā)滸、黃金海、李雪、田楨干等專家對(duì)LAMP檢測步驟的建立、檢測的應(yīng)用等進(jìn)行了深入的研究。通過他們的實(shí)踐，結(jié)合近年來的理論研究再一次證明了LAMP的檢測結(jié)果高于國際通過方法，由此可見，該方式更為快速，結(jié)果更為精確。

雖然細(xì)菌分離培養(yǎng)的方式現(xiàn)階段的應(yīng)用仍然比較廣泛，但是其操作程序比較復(fù)雜，需要經(jīng)過前增菌、分離、生化等諸多步驟，得到陰性檢測結(jié)果通常需要大約4天的時(shí)間，檢測沙門氏菌時(shí)利用該方式得出結(jié)果至少需要七天的時(shí)間，因此在急需檢測結(jié)果的時(shí)候就不能使用了。另外，細(xì)菌的分離需要進(jìn)行兩次增菌后才能繼續(xù)分離培養(yǎng)的方式，生化鑒定的程序十分復(fù)雜繁瑣，并需要借助于微生物鑒定系統(tǒng)，經(jīng)常出現(xiàn)血清分型價(jià)效低的問題，所用到的試劑不僅價(jià)格高，而且容易失效，鑒定所需要的機(jī)械設(shè)備也十分昂貴，不能廣泛推廣使用。LAMP方法在提取出核酸之后就能直接擴(kuò)增，一個(gè)小時(shí)后即可完成擴(kuò)增過程，經(jīng)過24小時(shí)即可得出檢測結(jié)果，肉眼直接就能觀察，更加方便、快捷、直觀。本文將LAMP檢測與細(xì)菌分離檢測的方式進(jìn)行對(duì)比，對(duì)125份食品樣本中的沙門菌進(jìn)行檢測。通過對(duì)結(jié)果的分析表明，這兩種方式的檢測結(jié)果中陽性率存在十分顯著的差異，LAMP的陽性率為11.2%，細(xì)菌分離培養(yǎng)為5.6%，前者顯著高于后者。

結(jié)語

由以上研究的結(jié)果對(duì)比可知，在食品沙門氏菌檢驗(yàn)中應(yīng)用LAMP方式，操作更加簡便，結(jié)果也更能快速得到，結(jié)果更加精確，相較于細(xì)菌分離培養(yǎng)方式具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，能夠進(jìn)行食品衛(wèi)生的初步檢驗(yàn)。但是該方式只能檢測沙門氏菌的通用核酸，不能鑒定分型與分離菌株，因此可以將LAMP方式與分離培養(yǎng)法配合進(jìn)行。