趨化因子CXC配體12/CXC受體4在前列腺癌細(xì)胞的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖的作用機(jī)制

曲修勝 劉媛媛 孫華威 梁立春 李 玥 齊亞靈 王偉群

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154002)

趨化因子CXC配體12/CXC受體4在前列腺癌細(xì)胞的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖的作用機(jī)制

曲修勝 劉媛媛 孫華威 梁立春1李 玥1齊亞靈2王偉群1

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154002)

目的 檢測(cè)DU145、PC-3和LNCaP前列腺癌細(xì)胞中趨化因子CXC配體(L)12及其受體(R)4的表達(dá)，探討重組人CXCL12對(duì)上述細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制。方法 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)研究CXCL12/CXCR4在DU145、PC-3和LNCaP細(xì)胞的表達(dá)；CCK-8實(shí)驗(yàn)研究重組人CXCL12對(duì)DU145、PC-3和LNCaP細(xì)胞增殖的作用；Wettern印跡實(shí)驗(yàn)研究重組人CXCL12對(duì)DU145細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和磷酶化ERK(pERK)表達(dá)的影響。結(jié)果 DU145、PC-3和LNCaP細(xì)胞均表達(dá)CXCL12和CXCR4，重組人CXCL12可明顯促進(jìn)上述細(xì)胞的增殖，重組人CXCL12雖然不能改變DU145細(xì)胞ERK1/2表達(dá)，但可上調(diào)pERK1/2的表達(dá)。結(jié)論 前列腺癌細(xì)胞表達(dá)CXCL12 及其受體CXCR4，CXCL12/CXCR4可通過(guò)活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信號(hào)通路促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖。

前列腺癌；趨化因子CXC配體(L)12；CXC受體(R)4；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)

前列腺癌是臨床上最常見(jiàn)的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其致死率位列所有男性腫瘤的第二位〔1〕。目前認(rèn)為，前列腺癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，高危因素包括年齡、吸煙、炎癥、雄激素水平、飲食和遺傳等。其中，炎癥反應(yīng)在惡性腫瘤中的作用越來(lái)越引起人們的關(guān)注，其已被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的第七大危險(xiǎn)因素〔2〕。趨化因子屬于細(xì)胞因子超家族成員，其具有吸引、活化、調(diào)節(jié)各種類型白細(xì)胞運(yùn)輸?shù)墓δ堋＝陙?lái)的研究成果表明，趨化因子也可通過(guò)促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中血管的生成、腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移而參與腫瘤的發(fā)生與演進(jìn)過(guò)程〔3〕。本研究觀察趨化因子CXC配體(L)12及其受體(R)4在前列腺癌細(xì)胞的表達(dá)并探討CXCL12對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及試劑 人類前列腺癌細(xì)胞系DU145、PC-3和 LNCaP(中科院上海細(xì)胞庫(kù)，中國(guó))，胎牛血清(NQBB，美國(guó))，青、鏈霉素和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)8(博士德，中國(guó))，RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，Trizol(Invitrogen，美國(guó))，TIANScript RT試劑盒(天跟，中國(guó))，外源性CXCL12(PeproTech，美國(guó))，苯甲基磺酰氟(PMSF)、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天，中國(guó))，兔抗細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和兔抗磷酸化ERK(pERK)(Affinity，美國(guó))，鼠抗β-actin、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(中杉金橋，中國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) DU145、PC-3和 LNCaP細(xì)胞被接種和培養(yǎng)在含10% 胎牛血清、100 μg/ml青、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，待細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時(shí)，細(xì)胞受胰蛋白酶消化，離心后收集細(xì)胞沉淀或傳代，備用。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)實(shí)驗(yàn) 用Trizol試劑常規(guī)提取DU145、PC-3和LNCaP細(xì)胞的總RNA并測(cè)量其濃度，利用TIANScript RT試劑盒按操作規(guī)程將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并行PCR實(shí)驗(yàn)。PCR擴(kuò)增中各基因引物及PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

表1 PCR引物及反應(yīng)條件

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期DU145、PC-3和 LNCaP細(xì)胞重懸于RPMI1640完全培養(yǎng)基中(含10% 胎牛血清、100 μg/ml青、鏈霉素)。待計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞后，將1.5×103細(xì)胞/孔分別接種于96孔板中，并于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。待第2天細(xì)胞完全貼壁后，小心吸取培養(yǎng)基，向每孔中加入含外源性CXCL12完全培養(yǎng)基100 μl，使各孔中外源性CXCL12終濃度分別為0、10、20、40和 60 ng/ml，將孔板置于上述培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.5 Western印跡實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞培養(yǎng)在10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上后，收集細(xì)胞沉淀，加入含PMSF 的RIPA蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞，待BCA蛋白定量試劑盒測(cè)量各樣本濃度后將樣本存于-80℃冰箱中備用。Western印跡流程如下：取50 μg的總蛋白于12%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠中電泳(電壓為110 V)；將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(電流為300 mA，2 h)；5%的脫脂奶粉室溫封閉3 h；Tween-20磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜3×5 min；一抗4℃孵育過(guò)夜(β-actin、ERK和pERK濃度均為1∶1 000)，PBST洗膜3×5 min； HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000)37℃孵育45 min；PBST洗膜4×5 min；向膜上加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液，并于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中曝光、拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件行q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 前列腺癌細(xì)胞表達(dá)CXCL12及其受體CXCR4 DU145、PC-3和 LNCaP均表達(dá)CXCL12及其受體CXCR4。見(jiàn)圖1。半定量分析表明，與PC-3(0.51±0.08)和DU145(0.29±0.06)比較，LNCaP細(xì)胞 CXCL12 mRNA表達(dá)量(1.34±0.14)明顯增高，而CXCR4的mRNA水平在DU145中最高(0.99±0.08)，LNCaP次之(0.62±0.09)，PC-3最低(0.47±0.06)。

圖1 前列腺癌細(xì)胞表達(dá)CXCL12及CXCR2 mRNA

2.2 外源性CXCL12促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源性CXCL12均可促進(jìn)DU145、PC-3和 LNCaP的增殖，但是各細(xì)胞促進(jìn)增殖的濃度有明顯差異(P<0.05)，DU145的促增殖濃度為10、20和40 ng/ml，PC-3為60 ng/ml，而LNCaP為10、20、40和60 ng/ml。見(jiàn)表2。

2.3 外源性CXCL12促進(jìn)DU145細(xì)胞ERK磷酸化(pERK) 與0 ng/ml CXCL12(0.70±0.35、0.55±0.13)比較，10、40 ng/ml的CXCL12不能改變ERK的水平(1.01±0.15、0.94±0.14，P>0.05)，但可明顯促進(jìn)pERK的表達(dá)(1.55±0.14、1.56±0.18，P<0.05)。見(jiàn)圖2。

組別0ng/ml10ng/ml20ng/ml40ng/ml60ng/mlDU1450.553±0.080.636±0.061)0.666±0.032)0.753±0.042)0.647±0.04PC-30.491±0.040.526±0.060.529±0.060.541±0.040.610±0.031)LNCaP0.609±0.100.768±0.031)0.848±0.051)0.864±0.041)0.837±0.031)

與0 ng/ml比較：1)P<0.05；2)P<0.01

1～3：0、10、40 ng/ml CXCL12圖2 外源性CXCL12上調(diào)DU145 細(xì)胞pERK水平

3 討 論

前列腺癌在歐美被稱為男性健康的第一大殺手，其發(fā)病率位居西方世界男性惡性腫瘤的第一位，而死亡率也已升至第二位，僅次于肺癌〔4〕。前列腺癌在北京男性泌尿生殖系腫瘤中排名第一位、所有腫瘤疾病中排名第五位〔5〕。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體在進(jìn)化演進(jìn)過(guò)程中形成的具有抵抗及清除病原微生物、異物及壞死組織的一種保護(hù)機(jī)制。該過(guò)程有助于生物體清除異己，從而保證個(gè)體的生存，但炎癥的長(zhǎng)期存在，即慢性炎癥，也會(huì)導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生〔6〕。全球約25%的腫瘤是由炎癥發(fā)展而來(lái)的〔7〕。

趨化因子屬于細(xì)胞因子超家族成員，根據(jù)鄰近氨基端結(jié)構(gòu)性半胱氨酸的排列，其可被分為CXC、CX3C、CC和C四個(gè)亞家族。其中CXC亞家族又可依據(jù)第一個(gè)保守半胱氨酸前是否存有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步分為ELR+CXC和ELR-CXC兩類。盡管趨化因子在炎癥和免疫反應(yīng)中可以活化、吸引及調(diào)節(jié)粒細(xì)胞的遷移，但越來(lái)越多的證據(jù)顯示，趨化因子也參與了腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成〔8〕。

作為ELR+CXC類趨化因子中的一員，CXCL12是CXCR4的唯一配體。有研究已經(jīng)證實(shí)，CXCL12/CXCR4參與了多種腫瘤的發(fā)生與演進(jìn)過(guò)程。在包括卵巢癌、小細(xì)胞肺癌和腦膠質(zhì)瘤的許多腫瘤中，CXCL12均可促進(jìn)表達(dá)CXCR4腫瘤細(xì)胞的增殖與存活〔9～11〕。另外，CXCL12也參與腫瘤細(xì)胞的特異性器官轉(zhuǎn)移，Müller等〔12〕研究表明，CXCR4高表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌組織，而乳腺癌常轉(zhuǎn)移的靶組織則高表達(dá)其配體CXCL12，CXCR4可介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的聚合和偽足形成，并借助受體與配體的特異性結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)其向靶組織的趨化及轉(zhuǎn)移，這就是所謂的“歸巢學(xué)說(shuō)”，而阻斷CXCL12/CXCR4的相互作用，則可抑制癌細(xì)胞的歸巢和遷移。本研究提示，CXCL12的表達(dá)可能與雄激素信號(hào)有關(guān)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明外源性給予CXCL12均可促進(jìn)上述細(xì)胞的增殖，而當(dāng)CXCL12濃度增加到一定數(shù)值后，其促DU145和LNCaP的增殖效應(yīng)有所下降。Begley等〔13〕的研究證實(shí)同為ELR+CXC類趨化因子的CXCL5對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖也具有雙向調(diào)節(jié)作用，即一定濃度的CXCL5可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，而超過(guò)一定濃度反而會(huì)出現(xiàn)抑制效應(yīng)；推斷這種現(xiàn)象可能與高濃度的配體導(dǎo)致受體下調(diào)有關(guān)。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK通路在腫瘤中的作用已被廣泛證實(shí)，其不僅參與了腫瘤細(xì)胞的增殖與血管發(fā)生，還在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用〔14～16〕。本研究結(jié)果表明，外源性CXCL12雖然不能改變ERK1/2表達(dá)，但可上調(diào)pERK1/2的表達(dá)。由此可見(jiàn)活化MAPK/ERK信號(hào)通路可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖。

1 Morales CP,Holt SE,Ouellette M,etal.Absence of cancer-associated changes in human fibroblasts immortalized with telomerase〔J〕.Nat Genet,1999;21(1):115-8.

2 Laskowski P,Klim B,Ostrowski K,etal.Local inflammatory response in colorectal cancer〔J〕.Pol J Pathol,2016;67(2):163-71.

3 Caronni N,Savino B,Recordati C,etal.Cancer and chemokines〔J〕.Methods Mol Biol,2016;1393:87-96.

4 Weingartner K,Ben-Sasson SA,Stewart R,etal.Endothelial cell proliferation activity in benign prostatic hyperplasia and prostate cancer:an in vitro model for assessment〔J〕.J Urol,1998;159(2):465-70.

5 葉定偉，朱 耀.中國(guó)前列腺癌的流行病學(xué)概述和啟示〔J〕.中華外科雜志，2015；53(4)：249-52.

6 Lin WW,Karin M.A cytokine-mediated link between innate immunity,inflammation,and cancer〔J〕.J Clin Invest,2007;117(5):1175-83.

7 Hussain SP,Harris CC.Inflammation and cancer:an ancient link with novel potentials〔J〕.Int J Cancer,2007;121(11):2373-80.

8 Strieter RM.Chemokines:not just leukocyte chemoattractants in the promotion of cancer〔J〕.Nat Immunol,2001;2(4):285-6.

9 Scotton CJ,Wilson JL,Scott K,etal.Multiple actions of the chemokine.CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer〔J〕.Cancer Res,2002;62(20):5930-8.

10 Phillips RJ,Burdick MD,Lutz M,etal.The stromal derived factor-1/CXCL12-CXC chemokine receptor 4 biological axis in non-small cell lung cancer metastases〔J〕.Am J Respir Crit Care Med,2003;167(12):1676-86.

11 Barbero S,Bonavia R,Bajetto A,etal.Stromal cell-derived factor 1alpha stimulates human glioblastoma cell growth through the activation of both extracellular signal-regulated kinases 1/2 and Akt〔J〕.Cancer Res,2003;63(8):1969-74.

12 Müller A,Homey B,Soto H,etal.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis〔J〕.Nature,2001;410(6824):50-6.

13 Begley LA,Kasina S,Mehra R.CXCL5 promotes prostate cancer progression〔J〕.Neoplasia,2008;10(3):244-54.

14 Chin CC,Li JM,Lee KF,etal.Selective β2-AR blockage suppresses colorectal cancer growth through regulation of EGFR-Akt/ERK1/2 signaling,G1-phase arrest,and apoptosis〔J〕.J Cell Physiol,2016;231(2):459-72.

15 Hou X,Zhang Y,Qiao H.CCL18 promotes the invasion and migration of gastric cancer cells via ERK1/2/NF-κB signaling pathway〔J〕.Tumour Biol,2016;37(1):641-51.

16 Teng JA,Wu SG,Chen JX,etal.The activation of ERK1/2 and JNK MAPK signaling by insulin/IGF-1 is responsible for the development of colon cancer with type 2 diabetes mellitus〔J〕.PLoS One,2016;11(2):e0149822.

〔2015-12-17修回〕

(編輯 苑云杰)

The expression of CXCL12/CXCR4 axis in prostate cancer cells and its action mechanism on cells proliferation

QU Xiu-Sheng,LIU Yuan-Yuan,SUN Hua-Wei,etal.

Medical Oncology,the First Affiliated Hospital,Jiamusi University,Jiamusi 154002,Heilongjiang,China

Objective To test the expression of chemotactic factor CXCL12 and its receptor CXCR4 in DU145,PC-3 and LNCaP prostate cancer cell,and explore the effect and mechanism of human recombinant CXCL12 on the proliferation of cells mentioned above.Methods RT-PCR experiments were utilized to study the expression of CXCL12/CXCR4 in DU145,PC-3 and LNCaP cells;CCK-8 experiments were used to investigate the proliferative effects of human recombinant CXCL12 on DU145,PC-3 and LNCaP cells;Western blot experiments were performed to explore the effect of human recombinant CXCL12 on the expression of ERK and pERK.Results CXCL12 and CXCR4 were expressed in DU145,PC-3 and LNCaP cells.Human recombinant CXCL12 obviously promoted proliferative response on the three cell lines,which didn’t change the expression of ERK1/2 in DU145 cells,whereas up-regulated pERK1/2 expressionConclusions Prostate cancer cells express CXCL12 and its receptor CXCR4,CXCL12/CXCR4 axis contributes prostate cancer cells proliferation by activating MAPK/ERK signaling pathway.

Prostate cancer;CXCL12;CXCR4;ERK

國(guó)家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目(No.81272854)；黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.D201129)；佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(No.YM2016_006)

1 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 2 海南醫(yī)學(xué)院

王偉群(1974-)，男，醫(yī)學(xué)博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤病理生理學(xué)研究。 齊亞靈(1967-)，女，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤發(fā)病機(jī)制研究。

曲修勝(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤放化療研究。

R737.25

A

1005-9202(2017)07-1568-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.003