趨化因子CXC配體12/CXC受體4在前列腺癌細胞的表達及其對細胞增殖的作用機制

曲修勝 劉媛媛 孫華威 梁立春 李 玥 齊亞靈 王偉群

(佳木斯大學附屬第一醫院腫瘤內科，黑龍江 佳木斯 154002)

趨化因子CXC配體12/CXC受體4在前列腺癌細胞的表達及其對細胞增殖的作用機制

曲修勝 劉媛媛 孫華威 梁立春1李 玥1齊亞靈2王偉群1

(佳木斯大學附屬第一醫院腫瘤內科，黑龍江 佳木斯 154002)

目的 檢測DU145、PC-3和LNCaP前列腺癌細胞中趨化因子CXC配體(L)12及其受體(R)4的表達，探討重組人CXCL12對上述細胞增殖的影響及其機制。方法 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)研究CXCL12/CXCR4在DU145、PC-3和LNCaP細胞的表達；CCK-8實驗研究重組人CXCL12對DU145、PC-3和LNCaP細胞增殖的作用；Wettern印跡實驗研究重組人CXCL12對DU145細胞外調節蛋白激酶(ERK)和磷酶化ERK(pERK)表達的影響。結果 DU145、PC-3和LNCaP細胞均表達CXCL12和CXCR4，重組人CXCL12可明顯促進上述細胞的增殖，重組人CXCL12雖然不能改變DU145細胞ERK1/2表達，但可上調pERK1/2的表達。結論 前列腺癌細胞表達CXCL12 及其受體CXCR4，CXCL12/CXCR4可通過活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信號通路促進前列腺癌細胞的增殖。

前列腺癌；趨化因子CXC配體(L)12；CXC受體(R)4；細胞外調節蛋白激酶(ERK)

前列腺癌是臨床上最常見的泌尿生殖系統惡性腫瘤之一，其致死率位列所有男性腫瘤的第二位〔1〕。目前認為，前列腺癌的發生與多種因素有關，高危因素包括年齡、吸煙、炎癥、雄激素水平、飲食和遺傳等。其中，炎癥反應在惡性腫瘤中的作用越來越引起人們的關注，其已被認為是癌癥發生的第七大危險因素〔2〕。趨化因子屬于細胞因子超家族成員，其具有吸引、活化、調節各種類型白細胞運輸的功能。近年來的研究成果表明，趨化因子也可通過促進腫瘤微環境中血管的生成、腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移而參與腫瘤的發生與演進過程〔3〕。本研究觀察趨化因子CXC配體(L)12及其受體(R)4在前列腺癌細胞的表達并探討CXCL12對前列腺癌細胞增殖的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及試劑 人類前列腺癌細胞系DU145、PC-3和 LNCaP(中科院上海細胞庫，中國)，胎牛血清(NQBB，美國)，青、鏈霉素和細胞計數試劑盒(CCK)8(博士德，中國)，RPMI1640培養基(Gibco，美國)，Trizol(Invitrogen，美國)，TIANScript RT試劑盒(天跟，中國)，外源性CXCL12(PeproTech，美國)，苯甲基磺酰氟(PMSF)、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天，中國)，兔抗細胞外調節蛋白激酶(ERK)和兔抗磷酸化ERK(pERK)(Affinity，美國)，鼠抗β-actin、辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(中杉金橋，中國)。

1.2 細胞培養 DU145、PC-3和 LNCaP細胞被接種和培養在含10% 胎牛血清、100 μg/ml青、鏈霉素的RPMI1640培養基中，待細胞密度達到90%以上時，細胞受胰蛋白酶消化，離心后收集細胞沉淀或傳代，備用。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)實驗 用Trizol試劑常規提取DU145、PC-3和LNCaP細胞的總RNA并測量其濃度，利用TIANScript RT試劑盒按操作規程將2 μg總RNA逆轉錄成cDNA，并行PCR實驗。PCR擴增中各基因引物及PCR反應條件見表1。

表1 PCR引物及反應條件

1.4 細胞增殖實驗 取對數生長期DU145、PC-3和 LNCaP細胞重懸于RPMI1640完全培養基中(含10% 胎牛血清、100 μg/ml青、鏈霉素)。待計數板計數細胞后，將1.5×103細胞/孔分別接種于96孔板中，并于37℃含5% CO2培養箱中培養過夜。待第2天細胞完全貼壁后，小心吸取培養基，向每孔中加入含外源性CXCL12完全培養基100 μl，使各孔中外源性CXCL12終濃度分別為0、10、20、40和 60 ng/ml，將孔板置于上述培養箱中繼續培養，72 h后用CCK8試劑盒檢測細胞增殖情況。

1.5 Western印跡實驗 將細胞培養在10 cm培養皿中，待細胞融合度達到90%以上后，收集細胞沉淀，加入含PMSF 的RIPA蛋白裂解液充分裂解細胞，待BCA蛋白定量試劑盒測量各樣本濃度后將樣本存于-80℃冰箱中備用。Western印跡流程如下：取50 μg的總蛋白于12%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠中電泳(電壓為110 V)；將凝膠中蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(電流為300 mA，2 h)；5%的脫脂奶粉室溫封閉3 h；Tween-20磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜3×5 min；一抗4℃孵育過夜(β-actin、ERK和pERK濃度均為1∶1 000)，PBST洗膜3×5 min； HRP標記的二抗(1∶10 000)37℃孵育45 min；PBST洗膜4×5 min；向膜上加入電化學發光(ECL)顯影液，并于全自動化學發光系統中曝光、拍照。

1.6 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件行q檢驗。

2 結 果

2.1 前列腺癌細胞表達CXCL12及其受體CXCR4 DU145、PC-3和 LNCaP均表達CXCL12及其受體CXCR4。見圖1。半定量分析表明，與PC-3(0.51±0.08)和DU145(0.29±0.06)比較，LNCaP細胞 CXCL12 mRNA表達量(1.34±0.14)明顯增高，而CXCR4的mRNA水平在DU145中最高(0.99±0.08)，LNCaP次之(0.62±0.09)，PC-3最低(0.47±0.06)。

圖1 前列腺癌細胞表達CXCL12及CXCR2 mRNA

2.2 外源性CXCL12促進前列腺癌細胞增殖 細胞培養72 h后，CCK8實驗結果表明，外源性CXCL12均可促進DU145、PC-3和 LNCaP的增殖，但是各細胞促進增殖的濃度有明顯差異(P<0.05)，DU145的促增殖濃度為10、20和40 ng/ml，PC-3為60 ng/ml，而LNCaP為10、20、40和60 ng/ml。見表2。

2.3 外源性CXCL12促進DU145細胞ERK磷酸化(pERK) 與0 ng/ml CXCL12(0.70±0.35、0.55±0.13)比較，10、40 ng/ml的CXCL12不能改變ERK的水平(1.01±0.15、0.94±0.14，P>0.05)，但可明顯促進pERK的表達(1.55±0.14、1.56±0.18，P<0.05)。見圖2。

組別0ng/ml10ng/ml20ng/ml40ng/ml60ng/mlDU1450.553±0.080.636±0.061)0.666±0.032)0.753±0.042)0.647±0.04PC-30.491±0.040.526±0.060.529±0.060.541±0.040.610±0.031)LNCaP0.609±0.100.768±0.031)0.848±0.051)0.864±0.041)0.837±0.031)

與0 ng/ml比較：1)P<0.05；2)P<0.01

1～3：0、10、40 ng/ml CXCL12圖2 外源性CXCL12上調DU145 細胞pERK水平

3 討 論

前列腺癌在歐美被稱為男性健康的第一大殺手，其發病率位居西方世界男性惡性腫瘤的第一位，而死亡率也已升至第二位，僅次于肺癌〔4〕。前列腺癌在北京男性泌尿生殖系腫瘤中排名第一位、所有腫瘤疾病中排名第五位〔5〕。

炎癥反應是機體在進化演進過程中形成的具有抵抗及清除病原微生物、異物及壞死組織的一種保護機制。該過程有助于生物體清除異己，從而保證個體的生存，但炎癥的長期存在，即慢性炎癥，也會導致包括腫瘤在內的多種疾病發生〔6〕。全球約25%的腫瘤是由炎癥發展而來的〔7〕。

趨化因子屬于細胞因子超家族成員，根據鄰近氨基端結構性半胱氨酸的排列，其可被分為CXC、CX3C、CC和C四個亞家族。其中CXC亞家族又可依據第一個保守半胱氨酸前是否存有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)結構，進一步分為ELR+CXC和ELR-CXC兩類。盡管趨化因子在炎癥和免疫反應中可以活化、吸引及調節粒細胞的遷移，但越來越多的證據顯示，趨化因子也參與了腫瘤的增殖、侵襲、轉移及血管生成〔8〕。

作為ELR+CXC類趨化因子中的一員，CXCL12是CXCR4的唯一配體。有研究已經證實，CXCL12/CXCR4參與了多種腫瘤的發生與演進過程。在包括卵巢癌、小細胞肺癌和腦膠質瘤的許多腫瘤中，CXCL12均可促進表達CXCR4腫瘤細胞的增殖與存活〔9～11〕。另外，CXCL12也參與腫瘤細胞的特異性器官轉移，Müller等〔12〕研究表明，CXCR4高表達于乳腺癌細胞和乳腺癌組織，而乳腺癌常轉移的靶組織則高表達其配體CXCL12，CXCR4可介導乳腺癌細胞肌動蛋白的聚合和偽足形成，并借助受體與配體的特異性結合，以實現其向靶組織的趨化及轉移，這就是所謂的“歸巢學說”，而阻斷CXCL12/CXCR4的相互作用，則可抑制癌細胞的歸巢和遷移。本研究提示，CXCL12的表達可能與雄激素信號有關。細胞增殖實驗表明外源性給予CXCL12均可促進上述細胞的增殖，而當CXCL12濃度增加到一定數值后，其促DU145和LNCaP的增殖效應有所下降。Begley等〔13〕的研究證實同為ELR+CXC類趨化因子的CXCL5對前列腺癌細胞的增殖也具有雙向調節作用，即一定濃度的CXCL5可促進癌細胞增殖，而超過一定濃度反而會出現抑制效應；推斷這種現象可能與高濃度的配體導致受體下調有關。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK通路在腫瘤中的作用已被廣泛證實，其不僅參與了腫瘤細胞的增殖與血管發生，還在腫瘤的侵襲和轉移中發揮重要作用〔14～16〕。本研究結果表明，外源性CXCL12雖然不能改變ERK1/2表達，但可上調pERK1/2的表達。由此可見活化MAPK/ERK信號通路可促進前列腺癌細胞的增殖。

1 Morales CP,Holt SE,Ouellette M,etal.Absence of cancer-associated changes in human fibroblasts immortalized with telomerase〔J〕.Nat Genet,1999;21(1):115-8.

2 Laskowski P,Klim B,Ostrowski K,etal.Local inflammatory response in colorectal cancer〔J〕.Pol J Pathol,2016;67(2):163-71.

3 Caronni N,Savino B,Recordati C,etal.Cancer and chemokines〔J〕.Methods Mol Biol,2016;1393:87-96.

4 Weingartner K,Ben-Sasson SA,Stewart R,etal.Endothelial cell proliferation activity in benign prostatic hyperplasia and prostate cancer:an in vitro model for assessment〔J〕.J Urol,1998;159(2):465-70.

5 葉定偉，朱 耀.中國前列腺癌的流行病學概述和啟示〔J〕.中華外科雜志，2015；53(4)：249-52.

6 Lin WW,Karin M.A cytokine-mediated link between innate immunity,inflammation,and cancer〔J〕.J Clin Invest,2007;117(5):1175-83.

7 Hussain SP,Harris CC.Inflammation and cancer:an ancient link with novel potentials〔J〕.Int J Cancer,2007;121(11):2373-80.

8 Strieter RM.Chemokines:not just leukocyte chemoattractants in the promotion of cancer〔J〕.Nat Immunol,2001;2(4):285-6.

9 Scotton CJ,Wilson JL,Scott K,etal.Multiple actions of the chemokine.CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer〔J〕.Cancer Res,2002;62(20):5930-8.

10 Phillips RJ,Burdick MD,Lutz M,etal.The stromal derived factor-1/CXCL12-CXC chemokine receptor 4 biological axis in non-small cell lung cancer metastases〔J〕.Am J Respir Crit Care Med,2003;167(12):1676-86.

11 Barbero S,Bonavia R,Bajetto A,etal.Stromal cell-derived factor 1alpha stimulates human glioblastoma cell growth through the activation of both extracellular signal-regulated kinases 1/2 and Akt〔J〕.Cancer Res,2003;63(8):1969-74.

12 Müller A,Homey B,Soto H,etal.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis〔J〕.Nature,2001;410(6824):50-6.

13 Begley LA,Kasina S,Mehra R.CXCL5 promotes prostate cancer progression〔J〕.Neoplasia,2008;10(3):244-54.

14 Chin CC,Li JM,Lee KF,etal.Selective β2-AR blockage suppresses colorectal cancer growth through regulation of EGFR-Akt/ERK1/2 signaling,G1-phase arrest,and apoptosis〔J〕.J Cell Physiol,2016;231(2):459-72.

15 Hou X,Zhang Y,Qiao H.CCL18 promotes the invasion and migration of gastric cancer cells via ERK1/2/NF-κB signaling pathway〔J〕.Tumour Biol,2016;37(1):641-51.

16 Teng JA,Wu SG,Chen JX,etal.The activation of ERK1/2 and JNK MAPK signaling by insulin/IGF-1 is responsible for the development of colon cancer with type 2 diabetes mellitus〔J〕.PLoS One,2016;11(2):e0149822.

〔2015-12-17修回〕

(編輯 苑云杰)

The expression of CXCL12/CXCR4 axis in prostate cancer cells and its action mechanism on cells proliferation

QU Xiu-Sheng,LIU Yuan-Yuan,SUN Hua-Wei,etal.

Medical Oncology,the First Affiliated Hospital,Jiamusi University,Jiamusi 154002,Heilongjiang,China

Objective To test the expression of chemotactic factor CXCL12 and its receptor CXCR4 in DU145,PC-3 and LNCaP prostate cancer cell,and explore the effect and mechanism of human recombinant CXCL12 on the proliferation of cells mentioned above.Methods RT-PCR experiments were utilized to study the expression of CXCL12/CXCR4 in DU145,PC-3 and LNCaP cells;CCK-8 experiments were used to investigate the proliferative effects of human recombinant CXCL12 on DU145,PC-3 and LNCaP cells;Western blot experiments were performed to explore the effect of human recombinant CXCL12 on the expression of ERK and pERK.Results CXCL12 and CXCR4 were expressed in DU145,PC-3 and LNCaP cells.Human recombinant CXCL12 obviously promoted proliferative response on the three cell lines,which didn’t change the expression of ERK1/2 in DU145 cells,whereas up-regulated pERK1/2 expressionConclusions Prostate cancer cells express CXCL12 and its receptor CXCR4,CXCL12/CXCR4 axis contributes prostate cancer cells proliferation by activating MAPK/ERK signaling pathway.

Prostate cancer;CXCL12;CXCR4;ERK

國家自然科學基金面上資助項目(No.81272854)；黑龍江省自然科學基金資助項目(No.D201129)；佳木斯大學研究生科技創新項目(No.YM2016_006)

1 佳木斯大學基礎醫學院 2 海南醫學院

王偉群(1974-)，男，醫學博士，副教授，碩士生導師，主要從事腫瘤病理生理學研究。 齊亞靈(1967-)，女，醫學博士，教授，博士生導師，主要從事腫瘤發病機制研究。

曲修勝(1979-)，男，主治醫師，主要從事腫瘤放化療研究。

R737.25

A

1005-9202(2017)07-1568-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.003