MBD2在老年胃癌中的表達及其對胃癌細胞多藥耐藥性的作用

韓雪晶

(徐州醫科大學附屬醫院消化內科，江蘇 徐州 221002)

MBD2在老年胃癌中的表達及其對胃癌細胞多藥耐藥性的作用

韓雪晶

(徐州醫科大學附屬醫院消化內科，江蘇 徐州 221002)

目的 探討甲基化CpG結合域蛋白質2(MBD2)在老年胃癌中的表達及其對胃癌細胞多藥耐藥性的作用。方法 采用免疫組化染色法檢測70份老年胃癌組織及其相應的癌旁組織標本中的MBD2表達情況，并分析其表達水平與病理參數的關系。Western印跡檢測MBD2在胃癌細胞系SCG7901及其耐藥細胞系中的表達。使用MBD2的小干擾RNA靜默MBD2表達后，通過MTT試驗檢測化療藥物順鉑、5-氟尿嘧啶對胃癌細胞的半數抑制濃度(IC50)。結果 MBD2在胃癌組織中陽性表達率為72.86%，明顯低于相應的癌旁組織中的92.86%(P<0.01)。MBD2在胃癌組織中表達與TNM分期、遠處轉移相關；其中MBD2在TNM分期為Ⅰ期和Ⅱ期的患者中陽性表達率明顯高于Ⅲ期和Ⅳ期患者(P<0.05)。SGC7901/阿霉素、GC7901/長春新堿中的MBD2/β-actin灰度比值明顯低于其親本細胞SGC7901(P<0.01)。SGC7901細胞和轉染無關序列對照寡核苷酸的SGC7901細胞MBD2/β-actin比值之間差異無統計學意義(P>0.05)；轉染MBD2特異性小干擾RNA的SGC7901細胞中MBD2/β-actin比值明顯低于上述兩株對照組細胞(P<0.05)。轉染MBD2特異性小干擾RNA的胃癌細胞對順鉑和5-氟尿嘧啶的IC50值均明顯高于轉染無關序列對照寡核苷酸的胃癌細胞(P<0.01)。結論 MBD2在老年胃癌組織中表達明顯降低，與臨床分期和遠處轉移有關，可抑制胃癌細胞的多藥耐藥性，說明MBD2表達失調參與了胃癌的發生、發展。

胃癌；甲基化CpG結合域蛋白質2；耐藥性

目前胃癌治療效果仍不理想，約40%的患者經化療后出現耐藥〔1，2〕。相關研究發現，腫瘤的多藥耐藥性不但與基因缺失、異位、突變有關，還與遺傳學改變存在相關性〔3〕。DNA甲基化是表觀遺傳學的重要調控機制之一，抑癌基因啟動子高甲基化是癌癥發生的一個重要因素。甲基化CpG結合域蛋白質(MBD)家族是一類與甲基化CpG二核苷酸相互結合的核蛋白，MBD2作為其成員，可將DNA甲基化與組蛋白修飾有機的聯合起來發揮樞紐作用，與細胞調控、腫瘤形成與發展有著緊密關系。相關研究顯示，MBD2在肺癌，特別是非小細胞肺癌，以及卵巢癌、前列腺癌、結腸癌組織中發揮明顯的轉錄靜默作用，導致MBD2與mRNA表達水平明顯低于正常組織〔4〕。本研究旨在了解MBD2在胃癌組織中的表達及其對胃癌細胞多藥耐藥性的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年1月至2016年1月間老年胃癌住院患者手術切除的胃癌及其相應的癌旁組織標本70份，其中男45例，女25例，年齡60～84歲；腺癌65例，未分化癌5例；TNM分期：1期3例、Ⅱ期27例、Ⅲ期34例、Ⅳ期6例；淋巴結轉移65例、無淋巴結轉移5例。人胃癌細胞系(SCG7901)，人胃癌耐藥細胞系(SGC7901/阿霉素、SGC7901/長春新堿)均購于上海慧穎生物科技有限公司。放于含10%胎牛血清的DMEM培養液中常規培養。

1.2 主要試劑 免疫組化檢測中兔抗人MeCP2多克隆抗體購自北京普利萊基因技術有限公司，鏈霉菌生物素蛋白-過氧化物酶(SP)試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司。兔抗人MBD2多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠二抗購于艾博抗(上海)貿易有限公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體、增強化學發光法(ECL)顯影試劑盒購于美國Sigma公司。MBD2小干擾RNA及無序列隊長寡核苷酸購于上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.3 免疫組化檢測MBD2在胃癌組織中表達 采用SP法，將胃癌組織常規脫蠟至水，常規抗原修復、山羊血清封閉后，依次孵育MBD2多克隆抗體和酶標記羊抗兔二抗。DAB顯色，常規脫水、透明、封固。高倍鏡視野下觀察，進行陽性細胞比例評分：陽性細胞比例≤1%為0分，2%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度評分：無色為0分，淺棕黃色為1分,棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞比例和染色強度評分的乘積為組織學評分：<4分為陰性，≥4分為陽性。

1.4 Western印跡檢測MBD2在胃癌細胞系中表達 取對數生長中期的胃癌細胞SCG7901，以及人胃癌耐藥細胞SGC7901/阿霉素、SGC7901/長春新堿，提取細胞總蛋白。常規方法將蛋白經SDS-PAGE分離后，濕法轉移至NC膜。以兔抗人MBD2和鼠抗人β-actin為一抗行Western印跡檢測。NC膜經ECL顯影液孵育后，使用E-gel Imager凝膠成像系統檢測，進行灰度分析，內參為β-actin，計算MBD2的相對表達量。

1.5 胃癌細胞的藥物敏感性檢測 使用MTT法檢測胃癌細胞的藥物IC50。對轉染了MBD2特異性小干擾RNA或無序列隊長寡核苷酸的胃癌細胞進行計數，鋪于96孔板，每孔4 000個細胞。加入順鉑或5-氟尿嘧啶，設6個濃度梯度，每個濃度設3個復孔，置于37℃、5%的CO2培養箱中孵育3 d，避光加入終濃度為0.05 mg/L的MTT，20 μl/孔，置于37℃、5% CO2培養箱中孵育4 h，棄去細胞培養液，每孔加入200 μl DMSO，振蕩溶解后，490 nm波長處測量吸光度值，計算藥物對胃癌細胞的抑制率和IC50。

1.6 統計學方法 應用SPSS20.0軟件行t檢驗，χ2檢驗。

2 結 果

2.1 MBD2在胃癌及其癌旁組織中的表達情況 免疫組化染色顯色，MBD2在癌旁組織中呈明顯陽性表達，在胃癌組織中陽性表達則較弱，MBD2在胃癌組織中陽性表達率為72.86%(51/70)，明顯低于相應的癌旁組織中的92.86%(65/70，χ2=15.192，P<0.01)，見圖1。

2.2 MBD2表達與臨床病理參數的關系 MBD2在胃癌組織中表達與TNM分期、遠傳轉移相關(P<0.05)；其中MBD2在TNM分期為Ⅰ期和Ⅱ期的患者中陽性表達率為80.00%(24/30)，明顯高于Ⅲ期和Ⅳ期患者的67.50%(27/40)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3 MBD2在人胃癌細胞中的表達 SGC7901/阿霉素、SGC7901/長春新堿中的MBD2/β-actin灰度比值分別為(0.582 6±0.021 6)、(0.651 2±0.017 5)，明顯低于其親本細胞SGC7901的(1.000±0.000；t=24.195、18.458；P<0.01)。SGC7901細胞和轉染無關序列對照寡核苷酸的SGC7901細胞中的MBD2/β-actin比值分別為(1.000±0.000)、(0.894 5±0.053 8)，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；轉染MBD2特異性小干擾RNA的SGC7901細胞中的MBD2/β-actin比值為(0.566 7±0.094 2)，明顯低于上述兩株對照組細胞(t=5.056、6.935；P<0.05)。見圖2，圖3。

圖2 MBD2在SGC7901及其耐藥細胞中的表達

1為SGC7901；2為轉染無關序列對照寡核苷酸的細胞表達；3為轉染MBD2特異性小干擾RNA的SGC7901圖3 MBD2在SGC7901細胞與轉染MBD2特異性小干擾RNA或無關序列對照寡核苷酸的細胞中表達

2.4 MBD2表達降低對胃癌細胞耐藥性的影響 轉染MBD2特異性小干擾RNA的胃癌細胞對順鉑和5-氟尿嘧啶的IC50值分別為(2.384±0.153 7)μg/ml、(11.439±0.358 2)μg/ml，均明顯高于轉染無關序列對照寡核苷酸的胃癌細胞對順鉑和5-氟尿嘧啶的IC50值(8.552±0.171 2)μg/ml、(0.895±0.027 5)μg/ml(t=16.490、9.264；P<0.01)。

3 討 論

腫瘤發生、發展過程中DNA甲基化是重要機制之一，多表現為大范圍的低甲基化和局部的高甲基化〔5〕。MBD家族是一類與甲基化CpG二核苷酸相互結合的核蛋白，該家族成員中具有相同的MBD，其中MBD2可與DNA上單一對稱的甲基化CpG相互結合，借助TRD和橋蛋白復合物、組蛋白乙酰化酶及其他共抑制子的相互作用，在甲基化位點處形成染色質結構，抑制轉錄因子與調控元件結合生成復合物〔6〕。研究已發現MBD2在肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸癌組織中發揮明顯的轉錄靜默作用，導致MBD2與mRNA表達水平明顯低于正常組織，但關于MBD2與胃癌關系的研究報道仍十分少見。

本次研究說明表達缺失或抑制是MBD2在胃癌組織中表達失調的主要形式。隨胃癌病情的進展MBD2表達水平有下降趨勢，提示MBD2表達抑制可能參與胃癌病情的發展。MBD2雖然與淋巴結轉移無關，但與胃癌遠處轉移存在明顯關聯，在遠處轉移的胃癌組織中有更多的MBD2表達，該結果與相關研究中MBD2在雌二醇受體陽性的乳腺癌中表達水平明顯高于陰性的報道相似〔7〕。提示MBD2不能簡單地歸結為腫瘤抑制分子。

化學治療是目前胃癌治療的主要手段之一，術前新輔助化療可有效促使腫瘤降期，術后化療可清除剩余的癌細胞和轉移灶。然而腫瘤的多藥耐藥性嚴重制約了化療的效果。相關研究認為，多種分子基因表達失調在多藥耐藥性產生中起到調控作用〔8〕。本次研究顯示，MBD2在胃癌耐藥細胞中表達水平明顯低于親本細胞，使用小干擾RNA降低其表達水平可有效提升胃癌細胞對順鉑、5-氟尿嘧啶的耐受性，說明MBD2可抑制胃癌細胞的多藥耐藥性。在胃癌病情發展過程中，MBD2的表達逐漸被抑制，有利于癌細胞獲得多藥耐藥性的特性，導致惡性表型不斷增強。

1 金紅順,徐 紅,王 京,等.老年胃癌的診療研究進展〔J〕.中國老年學雜志,2016;36(7):1773-4.

2 董 倩,陳 虎.順鉑聯合熱療對人胃癌耐藥細胞增殖及耐藥相關基因Survivin表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(13):3029-31.

3 Chen HY,Zhu BH,Zhang CH,etal.High CpG island methylator phenotype is associated with lymph node metastasis and prognosis in gastric cancer〔J〕.Cancer Sci,2012;103(1):73-9.

4 黃建軍,戈立東,周秀田,等.MiR-222與MBD2在結腸癌組織中的表達及其臨床意義〔J〕.中國癌癥雜志,2012;22(1):21-4.

5 Tahara T,Shibata T,Arisawa T,etal.CpG island promoter methylation (CIHM) status of tumor suppressor genes correlates with morphological appearances of gastric cancer〔J〕.Anticancer Res,2010;30(1):239-44.

6 蔣 蕾.3.0TMRI與多層螺旋CT區分胃癌術前分期的準確性比較〔J〕.中國衛生工程學,2016;15(5):513-5.

7 Joo MK,Kim KH,Park JJ,etal.CpG island promoter hypermethylation of Ras association domain family 1A gene contributes to gastric carcinogenesis〔J〕.Mol Med Rep,2015;11(4):3039-46.

8 楊叢蓮.奧沙利鉑黃芩素聯合應用對胃癌細胞抑制作用的影響研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2016;7(5):640-3.

〔2016-07-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

韓雪晶(1976-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事消化道腫瘤基礎與臨床研究。

R735.2

A

1005-9202(2017)07-1666-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.042