鴉膽子油逆轉奧沙利鉑耐藥胃癌SGC-7901細胞對奧沙利鉑的敏感性

楊 帆 高 翔 石玉萍 魏小果

(甘肅省人民醫院消化科，甘肅 蘭州 730000)

鴉膽子油逆轉奧沙利鉑耐藥胃癌SGC-7901細胞對奧沙利鉑的敏感性

楊 帆 高 翔 石玉萍 魏小果

(甘肅省人民醫院消化科，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討鴉膽子油增加奧沙利鉑(OXA)耐藥胃癌SGC-7901細胞(SGC-7901/COXA)對OXA敏感性的效果。方法 (1)建立SGC-7901/COXA細胞株。首先通過讓細胞持續接觸藥物的培養方法，并逐漸增加OXA的濃度，建立SGC-7901/COXA細胞株。(2)計算鴉膽子油及OXA對SGC-7901/COXA細胞增殖抑制率及藥物的IC50。取對數生長期SGC-7901/COXA細胞，培養24 h，然后加入不同濃度的鴉膽子油、OXA，繼續培養48 h后應用CCK8試劑測定各孔光吸收值(A)，取平均值，計算兩藥單獨對SGC-7901/CDDP細胞增殖抑制率及藥物的IC50。(3)計算兩藥聯合后SGC-7901/COXA細胞增殖抑制率、IC50逆轉倍數。選擇適宜的鴉膽子油濃度與不同濃度OXA聯合，重復CCK8法，計算兩藥聯合后SGC-7901/COXA細胞增殖抑制率、IC50、逆轉倍數。結果 鴉膽子油、OXA對SGC-7901/COXA細胞增殖具有抑制作用，該作用與濃度呈正相關。鴉膽子油、OXA對SGC-7901/COXA細胞的IC50分別為91.39 μg/ml和5.37 μg/ml。鴉膽子油聯合不同濃度OXA后對SGC-7901/COXA細胞增殖抑制作用明顯增強，聯合用藥后OXA的IC50降為1.29，逆轉耐藥倍數為4.16，因此SGC-7901/COXA對OXA敏感性明顯增強。結論 鴉膽子油與OXA聯合后SGC-7901/COXA對OXA的敏感性增加，相對單獨使用易產生耐藥性的缺點，兩者聯合后能有效提高SGC-7901/COXA對OXA的敏感性。

奧沙利鉑；胃癌；SGC-7901細胞；鴉膽子油

胃癌治療方案以手術切除為主，但因多數胃癌患者發現時已屬晚期，失去根治性手術治療機會。因此只能選擇以化學治療為主的綜合治療方案。回顧化療藥物的發展，從早期的氟尿嘧啶+阿霉素，到新一類以鉑類為主的化療方案，有效率亦僅有40%，難以進一步提高。而制約化療效果的一個關鍵因素是藥物的耐藥性，這是化療的瓶頸。中藥在化療減毒增效方面發揮重要作用。鴉膽子油是從鴉膽子果實中提純得到的脂肪油，具有抗腫瘤作用，而且與化療藥物合用具有減毒增效的作用，同時具有一定逆轉化療藥物耐藥作用(多藥耐藥逆轉和拓撲異構酶Ⅱ抑制作用)。本研究進一步驗證鴉膽子油能否增加SGC-7901/COXA對奧沙利鉑(OXA)敏感性的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 SGC-7901細胞(ATCC)；OXA(江蘇豪森)；鴉膽子油(沈陽藥大雷允上公司)；膽囊收縮素八肽(CCK8)試劑盒(日本同仁)；酶標儀(奧地利帝肯公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立SGC-7901/COXA細胞株 本研究采用大劑量間隙沖擊逐步增加劑量法建立SGC-7901/COXA細胞株。首先取對數生長期的胃癌SGC-7901細胞，用 0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液后，接種于25 cm2培養瓶中，根據預實驗的結果，應用含有0.125 μg/ml OXA(相當于抑制率為20%濃度)的RPMI 1640培養液培養，經過多次傳代，觀察細胞生長穩定無明顯變形，可增加藥物濃度，經過3個月的誘導，使胃癌SGC-7901細胞依次能在0.25、0.5、1、2 μg/ml RPMI 1640培養液中穩定生長和傳代，建立其耐藥細胞株。實驗觀察到耐藥細胞株增殖速度減慢，倍增時間延長。

1.2.2 應用CCK8法觀察鴉膽子油、OXA及兩藥聯合后SGC-7901/COXA細胞增殖抑制率、藥物的IC50、逆轉倍數。

取對數生長期的SGC-7901/COXA細胞，應用0.25%胰酶消化，制成2×104/ml單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μl，其中1孔留作空白孔，然后置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，使得細胞充分貼壁。然后將細胞從培養箱中取出，加入不同濃度的鴉膽子油和OXA，鴉膽子油各組終濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μg/ml，OXA各組終濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2 μg/ml，陰性對照組每孔加入100 μl RPMI 1640培養液，空白孔加200 μl普通培養液(不加細胞)，每個濃度組設6個復孔。加藥后將細胞再次置于培養箱中繼續培養48 h。然后按照每孔加入20 μl CCK8試劑，繼續培養2 h，即可用酶標儀測定各孔OD值，波長取490 nm。取6個復孔的平均值。計算藥物作用48 h的增殖抑制率。抑制率=〔1-(實驗組平均OD值-空白組平均OD值)/(陰性對照組平均OD值-空白組平均OD值)〕×100%。根據抑制率計算兩藥的IC50，然后選擇適宜的鴉膽子油與OXA聯合作用于SGC-7901/COXA細胞，重復CCK8方法，計算兩藥聯合后細胞增殖抑制率及逆轉倍數。

2 結 果

2.1 建立SGC-7901/COXA細胞株 根據預實驗及正式實驗結果，觀察到OXA對胃癌SGC-7901細胞的IC50為0.84 μg/ml，而OXA對SGC-7901/COXA細胞IC50為5.37 μg/ml，耐藥倍數為6.39。因此通過大劑量間隙沖擊逐步增加劑量法建立SGC-7901/COXA細胞株這種方法可行。

2.2 鴉膽子油、OXA及兩藥聯合后SGC-7901/COXA細胞增殖抑制率、藥物的IC50、逆轉倍數 根據鴉膽子油對SGC-7901/COXA細胞的增殖抑制作用結果，選擇濃度為30 μg/ml鴉膽子油(相當于IC30濃度)與不同濃度OXA聯合作用于SGC-7901/COXA細胞。鴉膽子油、OXA及兩者聯合對SGC-7901/COXA細胞增殖具有不同程度的抑制作用，并且抑制作用強度與濃度呈正相關。48 h鴉膽子油6.25 μg/ml抑制率(10.2±1.5)%,12.5 μg/ml抑制率(15.4±1.9)%,25 μg/ml抑制率(22.2±2.1)%,50 μg/ml抑制率(35.7±4.0)%,100 μg/ml抑制率(55.3±5.3)%；OXA 0.125 μg/ml抑制率(5.3±0.6)%,0.25 μg/ml抑制率(8.3±1.1)%,0.5 μg/ml抑制率(12.4±1.7)%,1 μg/ml抑制率(20.1±2.2)%,2 μg/ml抑制率(33.7±3.6)%；鴉膽子油+OXA 0.125 μg/ml抑制率(8.2±1.0)%,0.25 μg/ml抑制率(12.3±1.6)%,0.5 μg/ml抑制率(22.4±2.5)%,1 μg/ml抑制率(40.3±4.7)%,2 μg/ml抑制率(66.5±6.4)%。鴉膽子油聯合OXA后對SGC-7901/COXA細胞較單用OXA增殖抑制作用明顯增強，聯合用藥后OXA的IC50為1.29，逆轉耐藥倍數為4.16，因此SGC-7901/COXA細胞對OXA敏感性明顯增強。見圖1。

圖1 OXA單用與聯合鴉膽子油對SGC-7901/COXA 細胞增殖抑制對比

3 討 論

早期胃癌以手術切除治療為主，晚期胃癌以化療為主，目的主要在于提高患者生活質量及延長生存時間。OXA為第三代鉑類抗癌藥物，具有抗癌譜廣，溶解性和穩定性良好等優點，因此療效確切顯著，作為晚期胃癌標準治療方案〔1〕。國外一些關于OXA聯合化療方案研究結果表明，含OXA組患者總生存時間、有效率較順鉑組高，總生存時間10.7個月、有效率為41.3%，且血液、胃腸、腎毒性等不良反應發生率低〔2，3〕。鉑類藥物抗腫瘤作用機制為藥物進入細胞后，首先水解成化合物，然后進一步去質子化，生成羥基化的配位離子，與DNA鏈間或鏈內交聯，因此DNA 結構發生改變，導致DNA 轉錄復制終止，誘導腫瘤細胞凋亡和阻滯細胞周期，從而達到抗癌目的〔4〕。而鉑類藥物在發揮抗腫瘤作用的同時，也會激活體內一些其他的信號通過，這是其產生毒性不良反應和耐藥的原因〔5〕。

腫瘤細胞對鉑類藥物產生耐藥性的主要作用機制：(1)細胞內藥物有效濃度下降。藥物泵出增加、攝取減少及藥物失活都可引起細胞內藥物有效濃度下降。OXA在體內代謝主要依賴于谷胱甘肽轉移酶(GST)。GST不但具有解毒功能，還可促進DNA損傷的修復，因此可導致細胞耐藥發生。另外GST家族中人體腫瘤組織中存在大量的GSTP1，其作為GST家族中一員，可催化細胞內大量如谷胱甘肽(GSH)、金屬硫蛋白等巰基分子，這些物質與鉑類藥物共價結合后，使鉑類藥物停留在細胞質，不能進入細胞核內與DNA 發生交聯，使DNA產生損傷。另外還可增強鉑類藥物水溶性，使藥物排出增加，細胞內藥物有效濃度降低，藥物抗腫瘤活性減弱。(2)DNA損傷修復作用增強。因DNA 損傷修復在一定程度上可以削弱鉑類藥物誘導細胞凋亡作用。OXA在體內產生耐藥及敏感性降低主要與切除修復互補交叉基因(ERCC1)、ERCC2、ERCC5等核苷酸切除修復因子有關〔6〕。其中ERCC1 在NER 系統中具有DNA損傷修復和核酸內切酶的雙重功能，因此通過提高ERCC1 表達水平可以快速修復G2/M期的DNA 損傷，引起細胞對OXA耐藥反應。而ERCC2 則具有多個單核苷酸多態性，其介導751 位密碼子由Lys 轉變為Gln，影響OXA的治療效果。而ERCC5 作為一種結構特異性核酸酶，存在于多種腫瘤組織，其表達強弱與OXA藥物敏感性相關。(3)介導細胞凋亡信號轉導途徑異常〔7〕。若轉導途徑被異常激活或者被抑制，細胞就會對鉑類藥物產生抵抗及誘導細胞凋亡作用減弱。這些過程參與蛋白主要包括p53和Bcl-2家族蛋白〔8〕。另外，分泌型聚集素(sCLU)蛋白與OXA耐藥有關。sCLU可激活AKt 通路引起細胞對OXA耐藥反應，其表達水平與OXA介導癌細胞凋亡呈負相關〔9〕。

鴉膽子屬苦木科植物，從其干燥的成熟果實中可提取出脂肪油即鴉膽子油。鴉膽子油對多種癌癥的治療通過抑制拓撲異構酶的活性，進一步抑制細胞DNA 的復制、轉錄、重組，阻斷癌細胞從G0/G1期細胞發展到S期；上調caspase信號通路周期相關蛋白p53，達到抑制癌細胞增殖、誘導細胞凋亡的目的。鴉膽子油還可以破壞細胞質膜系統、線粒體系統、粗面內質網細胞器等發揮直接殺傷癌細胞作用〔10〕。諸多研究提示鴉膽子油與化療藥物聯合應用，可提高治療效果，同時降低惡心嘔吐等不良反應的發生，并能減少化療藥物導致出現的骨髓抑制、血常規下降等副反應〔11〕。耿國軍等〔12〕通過鴉膽子油作用到肺腺癌細胞SPA-A1后觀察結果，肺腺癌細胞呈凋亡形態學改變，將肺癌腺細胞(SPA-A1)阻滯于G0/G1期；抑制肺腺癌SPA-A1細胞增殖，誘導細胞凋亡。魏紅斌〔13〕通過對325例胃癌患者進行meta分析，結果發現鴉膽子油聯合化療方案對胃癌患者進行治療后，能提高胃癌患者療效，生活質量得以改善，化療藥物副作用減輕。楊凡等〔14〕研究認為鴉膽子油聯合化療能提高結腸癌患者化療效果，同時減輕化療的副反應，具有增效減毒作用。有研究發現，OXA可影響鈉、鈣離子交換通道，從而引起神經毒性的發生〔15〕。相關實驗研究發現鴉膽子油對多藥耐藥具有逆轉作用，并能明顯抑制ONA拓撲異構酶(TOPO)Ⅱ的活性。湯濤等〔16〕進行體外腫瘤細胞增殖生長抑制實驗研究發現，鴉膽子油乳濃度為0.025 g/L時能在一定程度上逆轉K562/A02、MCF-7/ADM 和KB/VCR 等細胞的耐藥性。同時鴉膽子油能抑制由TOPOⅡ介導的κDNA 去連環作用，濃度為0.31 g/L時部分抑制TOPOⅡ酶活力，濃度為2.5 g/L可完全抑制ONA拓撲異構酶TOPOⅡ酶活力。所以當鴉膽子油與其他抗癌藥聯合應用時，鴉膽子油可發揮其耐藥逆轉作用，增強其他藥物對耐藥細胞的細胞毒作用。

本實驗從體外實驗進一步驗證了鴉膽子油聯合OXA臨床減毒增效作用，下一步將研究鴉膽子油逆轉OXA耐藥胃癌SGC-7901細胞對OXA敏感性的具體機制。

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〔2016-12-25修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

魏小果(1973-)，女，副主任醫師，主要從事消化系統腫瘤研究。 石玉萍(1966-)，女，主任醫師，主要從事消化系統腫瘤研究。

楊 帆(1983-)，女，碩士，主治醫師，主要從事消化系統腫瘤研究。

R735.2

A

1005-9202(2017)08-1854-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.014