黃芩苷誘導人乳腺癌細胞株MCF—7凋亡的機制研究

吳貴才?趙丹?曾青磊?李仕卓

[摘要] 目的 探討中草藥黃芩苷對人乳腺癌細胞株MCF-7的作用及此作用存在的內在機制。 方法 0μmol/L （NC）、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L的黃芩苷作用于人乳腺癌細胞株MCF-7不同時間后，觀察細胞形態(tài)，MTT法測黃芩苷對細胞增殖的影響，并用流式細胞儀檢測黃芩苷是否誘導細胞的凋亡，最后用RT-PCR來檢測凋亡相關基因mRNA的表達。 結果 在一定的時間和一定的黃芩苷藥物濃度的范圍內，黃芩苷能抑制人乳腺癌細胞株MCF-7的增殖和遷移并誘導人乳腺癌細胞株MCF-7的凋亡，50μmol/L組抑制MCF-7的遷移與對照組之間有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。而且能引起ERK信號通路中凋亡相關基因 mRNA表達量的變化。給藥組的caspase-3和caspase-9被激活，50μmol/L組bcl-2、bax與對照組之間有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結論 黃芩苷通過ERK這條信號通路激活caspase-3和caspase-9，下調bcl-2，上調p-ERK、bax、p38從而誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡。黃芩苷能夠顯現(xiàn)出較大的經(jīng)濟效益，且更重要的是能夠為乳腺癌患者提供新的藥物方案和治療思路。

[關鍵詞] 黃芩苷；信號通路；凋亡

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）05-14-05

[Abstract] Objective To explore the internal mechanism of chinese herbal medicine baicalin in induction of apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7. Methods After some time of 0μmol/L （NC）， 50μmol/L， 100μmol/L， 150μmol/L， 200μmol/L， 250μmol/L baicalin effected on human breast cancer cell line MCF-7， cell morphology was observed. MTT assay was used to detect the effect of Baicalin on cell proliferation. Flow cytometry was used to detect weather baicalin induced cell apoptosis or not. RT-PCR was used to detect the expression of apoptosis related gene mRNA. Results Within a certain period of time and a certain concentration of baicalin， baicalin could inhibit the proliferation and migration of human breast cancer cell line MCF-7 and induce the apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7. There was a significant difference between 50μmol/L group and control group on inhibition of MCF-7 migration （P<0.05）. Moreover， it could cause the change of the expression of apoptosis related gene mRNA in ERK signaling pathway. Caspase-3 and caspase-9 were activated. There was a significant difference on Bcl-2 and Bax between the 50umol/L group and the control group （P<0.05）. Conclusion Baicalin activates caspase-3 and caspase-9 through the ERK signaling pathway. Down regulation of Bcl-2， up regulation of p-ERK， Bax， p38， it induces apoptosis of breast cancer MCF-7 cells. Baicalin can show greater economic benefits. Whats more， it can provide a new medicine and treatment for breast cancer patients.

[Key words] Baicalin； Signaling pathway； Apoptosis

乳腺癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤，我國也不例外，大約占全球女性腫瘤的23%[1]。近年來，乳腺癌的患病者的年齡呈現(xiàn)年輕化的趨勢，并且乳腺癌的發(fā)病率逐年增長。在西方發(fā)達國家中，乳腺癌的發(fā)病率同樣位于女性惡性腫瘤的首位，發(fā)病率大約為0.1%[2]。研究表明，乳腺癌的發(fā)生與個人的生活方式、生活習慣、環(huán)境因素和飲食習慣的改變有密切關系。這可能是多個基因變異的累積，從而逐漸演變導致包括抗癌基因的失活和原癌基因的激活等異常[3]。腫瘤細胞具有兩個顯著的特征，即惡性增殖、侵襲轉移。所以當前乳腺癌研究的熱點之一就是抑制乳腺癌細胞的增殖與轉移并誘導乳腺癌細胞的凋亡[4-5]。目前乳腺癌的治療方式主要是放化療、手術、內分泌治療、靶向治療等綜合治療。但是化療的藥物毒副作用很大。內分泌治療又較為容易產(chǎn)生耐受，更有甚者，某些會出現(xiàn)雌孕激素受體由陽性轉為陰性的情況。因此，優(yōu)化乳腺癌的治療方案中藥物的選擇顯得尤為重要。隨著分子生物學與基礎醫(yī)學研究的進一步發(fā)展，傳統(tǒng)中藥越來越多的被用于各種常見疾病以及多各腫瘤的治療，并取得了較好的治療效果[6]。

黃芩苷作為一種天然的中草藥，近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有毒性低，價格便宜和較為廣泛的抗腫瘤活性，對肝癌、大腸癌、前列腺癌等腫瘤都具有一定的治療效果。目前對黃芩苷抗乳腺癌的研究還較少，特別是對于其抗乳腺癌的機制研究還較少見到。

1 材料與試劑

1.1 材料

購自于上海科學院細胞庫的人乳腺癌細胞株MCF-7。

1.2 藥物

黃芩苷（Baiclin）購自于上海源葉生物科技有限公司（國藥準字：H20073931），黃芩苷用于本研究純度超過99.90%，最終濃度是以相應培養(yǎng)基及DMSO稀釋為0μmol/L（NC）、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L用于本實驗。

1.3 主要儀器

蘇凈安泰潔凈工作臺：蘇凈安泰潔凈工作臺；顯微鏡：日本OLYMPUS公司；Real-time PCR儀：瑞士羅氏公司；RT-PCR儀：瑞士羅氏公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

MCF-7細胞株復蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，加入含100ml/L小牛血清DMEM的新鮮培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 MTT檢測細胞增殖

選取對數(shù)期生長且狀態(tài)較好的細胞，配制好細胞懸液的濃度，在5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中孵育，后加入濃度梯度的黃芩苷，在5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中孵育24、48、72h后，于倒置顯微鏡下觀察。 加入MTT溶液，終止培養(yǎng)，最后在每孔中加入DMSO，然后在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光度值用于分析。

2.3 Transwell檢測細胞的遷移能力

對數(shù)期生長良好的乳腺癌MCF-7細胞加入Transwell上室，置于200μL無血清的培養(yǎng)基中。Transwell下室加入600μL培養(yǎng)基其中含有20% FBS的培養(yǎng)，Transwell小室置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；處理后完整撕下Transwell小室基底膜，置于載玻片上，顯微鏡下觀察穿過底模的細胞數(shù)目，拍照，并統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)。

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

在乳腺癌MCF-7細胞生長狀態(tài)良好時，消化后用細胞培養(yǎng)液重懸后接種于6孔板中，過24h后，待細胞貼壁后，將不同濃度的黃芩苷作用48h；收集細胞上機，用流式細胞儀檢測細胞的早期凋亡和晚期凋亡。

2.5 Real-time PCR

將0μmol/L（NC）、50μmol/L、150μmol/L、250μmol/L四組濃度的黃芩苷作用于MCF-7細胞48h，提取RNA，逆轉錄后采用兩步染料嵌合熒光RT-PCR法檢測GAPDH 、Bax、Bcl-2、P38、p-ERK1和p-ERK2 mRNA表達水平，用 PCR儀進行分析。引物序列見表1。

3 結果

3.1 黃芩苷抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖

將0μmol/L（NC）、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L和250μmol/L濃度的黃芩苷分別作用于乳腺癌細胞MCF-7 24、48和72h后，乳腺癌細胞MCF-7的生長受到明顯的抑制，且在一定的時間和濃度范圍內呈時間、濃度依賴性。各給藥組與陰性對照組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2、圖1。

3.2 黃芩苷抑制乳腺癌細胞MCF-7的遷移

將有代表性的0μmol/L（NC）、50μmol/L、150μmol/L、250μmol/L四組濃度的黃芩苷作用于MCF-7細胞48h后，觀察各組細胞穿過Transwell小室聚碳烯膜的情況。100x高倍鏡下可見0μmol/L、

50μmol/L、150μmol/L、250μmol/L四組穿過Transwell小室聚碳烯膜的細胞數(shù)分別為：（144.00±27.22）個、（69.67±9.76）、（26.67±6.88）和（14.00±4.27）。50μmol/L組與對照組之間有統(tǒng)計學差異（P<0.05），余與陰性對照組之間均有統(tǒng)計學差異（P<0.05），見圖2。

3.3 黃芩苷誘導乳腺癌細胞MCF-7凋亡

將有代表性的0μmol/L（NC）、50μmol/L、150μmol/L、250μmol/L四組濃度的黃芩苷作用于MCF-7細胞48h后，用流式細胞儀檢測。結果顯示0μmol/L、50μmol/L、150μmol/L、250μmol/L四組細胞早期凋亡率（%）分別為（2.58±0.97）、（8.5±1.27）、（13.6±1.47）、（22.7±2.38），晚期凋亡率（%）分別為（2.38±0.72）、（5.0±0.39）、（15.0±2.39）、（39.8±4.59），各給藥組與陰性對照組之間無論是早期凋亡率還是晚期凋亡率均具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），見圖3。

3.4 黃芩苷調控乳腺癌細胞MCF-7凋亡相關mRNA的表達

將有代表性的0μmol/L（NC）、50μmol/L、150μmol/L、250μmol/L四組濃度的黃芩苷作用于MCF-7細胞48h，逆轉錄后，PCR結果顯示：與陰性對照組相比，50μmol/L、150μmol/L、250μmol/L三個加藥組中Bax、P38、p-ERK1、p-ERK2的mRNA表達量均呈顯著性遞增。而Bcl-2的mRNA表達量則呈顯著性遞減，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。50μmol/L組bcl-2、bax與對照組之間差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。值得注意的是50μmol/L 加藥組中p-ERK2的mRNA表達量雖較陰性對照組中增多，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖4。4 討論

在我國發(fā)達城市中，乳腺癌的發(fā)病率業(yè)已位居女性惡性腫瘤的首位[7]，并且乳腺癌的發(fā)病年齡逐漸呈現(xiàn)年輕化的特點。目前來講，最為棘手的問題是乳腺癌手術后的局部復發(fā)和轉移。所以如果有其它較好的手段，如新藥物、新基因等手段輔助手術聯(lián)合治療對于乳腺癌患者來說無疑是一利好。黃芩苷作為天然的中草藥，現(xiàn)有研究表明其對肝癌、大腸癌、前列腺癌等腫瘤均具有一定的治療效果。所以本實驗的目標就是揭示黃芩苷對乳腺癌細胞株MCF-7的影響。

在本次研究中，我們將不同濃度的黃芩苷加入到人乳腺癌細胞株MCF-7 24、48和72h后發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞MCF-7的生長受到明顯的抑制，且在一定的濃度范圍和一定的時間內呈現(xiàn)出時間和濃度的依賴性。這與先前在膀胱癌和前列腺癌中的研究是一致的[8-9]。而后我們選取有代表性的三個加藥組來做遷移實驗。發(fā)現(xiàn)加藥組相對于對照組來說，乳腺癌細胞穿過Transwell小室聚碳烯膜的數(shù)量顯著減少了。而且隨著加藥濃度升高，穿過的細胞數(shù)量越來越低，呈明顯的負相關趨勢。

細胞死亡通常分為兩個類別即細胞凋亡和細胞壞死：凋亡代表“主動的”程序性細胞死亡； 壞死則是代表“被動”的意外的細胞死亡[10]。而抗癌治療的關鍵就是誘導癌細胞的凋亡。有報告指出，黃芩苷能誘導前列腺癌細胞凋亡[11]，黃芩苷對乳腺癌有生長抑制效應[12]。所以為了揭示黃芩苷是否可以促進乳腺癌MCF-7細胞凋亡這個命題，我們用流式細胞儀檢測不同加藥組的細胞凋亡率，結果顯示隨著黃芩苷的濃度增加，加藥組無論是早期凋亡率還是晚期凋亡率都有了明顯的增加，且隨著濃度增加，凋亡率也顯著增加。

藥物一般通過外在途徑或細胞質途徑和內在途徑或線粒體途徑來誘導細胞凋亡。然而，無論是外在途徑還是內在途徑都通過caspase-3。內在途徑中，位于caspase-3上游的是caspase-9 [13]。在本實驗中，給藥組的caspase-9和caspase-3被激活。結果表明，caspase-3和caspase-9的被激活作為一種機制參與了用藥組誘導細胞凋亡的過程。Lee[14]等研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷通過下調bcl-2和上調Bax 蛋白表達水平，通過降低線粒體膜電位，從而促進細胞色素C的釋放，最后激活細胞內線粒體途徑，從而活化caspase-3而誘導乳腺癌細胞凋亡。還有報道稱，黃芩素的作用涉及ERK[15]及P38 MAPK和AKT的磷酸化[16]。本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)給藥組中Bax、P38、p-ERK1、p-ERK2的mRNA表達量呈遞增趨勢。而Bcl-2的mRNA量則呈遞減趨勢。給藥組中的Bcl-2表達量下降而Bax表達增加了，呈負相關。給藥組與陰性對照組相比較，均具有統(tǒng)計學意義。上述結果表明藥物組誘導的凋亡不僅涉及內在途徑，同時也通過下調Bcl-2基因和上調Bax基因起作用。綜上，黃芩苷通過ERK 信號通路激活caspase-3和caspase-9，下調bcl-2，上調p-ERK、bax、p38從而誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡。

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及多因素多基因，從開始到進展的多階段的復雜過程。中草藥作為轉化醫(yī)學的重要手段，深入研究中草藥黃芩苷，或許能夠顯現(xiàn)出較大的經(jīng)濟效益，且更重要的是能夠為乳腺癌患者提供新的藥物方案和治療思路。

[參考文獻]

[1] Parkin DM， Bray F， Ferlay J， et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin，2005，55（2）：74-108.

[2] Seitz HK，Pelucchi C，Bagnardi V， et al. Epidemiology and pathophysiology of alcohol and breast cancer[J]. Alcohol， 2012，47（3）：204-212.

[3] 牛瑞芳，楊毅，劉紅，等. 乳腺癌中癌基因抗癌基因表達分析[J]. 中國腫瘤臨床， 2003，30（3）：167-171.

[4] Li YY， Fu S， Wang XP， et al. Down-regulation of c9orf86 in human breast cancer cells inhibits cell proliferation，invasion and tumor growth and correlates with suvival of breast cancer patients[J]. PloS One，2013，8（8）：71764-71775.

[5] Androutsopoulos VP， Mahale S， Arroo RRJ， et al. Anticancer effects of the flavonoid diosmetin on cell cycle progression and proliferation of MDA-MB-468 breast cancer cells due to CYP1 activation[J]. Oncology Reports，2009，21（6）：1525-1534.

[6] 李敏華，唐健，王春亮. 甘草黃酮對長期大強度運動小鼠心肌損傷的保護作用[J].基因組學與應用生物學， 2015， 34（2）：290-295.

[7] Siegel R， Naishadham D， Jemal A. Cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin，2013，61（3）：11-30.

[8] Ikezoe T， Chen SS， Heber D， et al. Baicalin is a major component of PC-SPES which inhibits the proliferation of human cancer cells via apoptosis and cell cycel arrest[J]. Prostate， 2001， 49（4）：285-92.

[9] Chao JI， Su WC， Liu HF. Baicalein induces cancer cell death and proliferation retardation by the inhibition of CDC2 kinase and survivin associated with opposite role of p38 mitogen-activated protein kinase and AKT[J]. Mol Cancer Ther， 2007， 6（11）：3039-3048.

[10] Herr I， Debatin KM. Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy[J].Blood，2001， 98（9）：2603-2614.

[11] Chen S， Ruan Q， Bedner E， et al. Effects of the flavonoid baicalin and its metabolite baicalein on androgen receptor expression， cell cycel progression and apoptosis of prostate cancer cell lines[J]. Cell Prolif， 2001，34（5）： 293-304.

[12] Parajuli P， Joshee N， Rimando AM， et al. In vitro antitumor mechanisms of various scutellaria extracts and constituent flavonoids[J]. Planta Med，2009，75：41-48.

[13] Ghobrial IM， Witzig TE， Adjei AA. Targeting apoptosis pathways in cancer therapy. CA Cancer J Clin[J]， 2005；55：178-194.

[14] Lee JH， Li YC， Ip SW， et al. The role of Ca2+ in baicalein induced apooptosis in human breast MDA-MB-231 cancer cells through mitochondria-and caspase-3-dependent pathway[J]. Anticancer Res， 2008， 28（3A）：1701-1711.

[15] Peng CY， Pan SL， Huang YW， et al. Baicalein attenuates intimal hyperplasia after rat carotid balloon injury though arresting cell-cycle progression and inhibiting ERK， Akt， and NF-kappaB activity in vascular smooth-muscle cells[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2008，378：579-588.

[16] Chao JI， Su WC， Liu HF. Baicalein induces cancer cell death and proliferation retardation by the inhibition of CDC2 kinase and survivin associated with opposite role of p38 mitogen-activated protein kinase and AKT[J]. Mol Cancer Ther，2007，6：3039-3048.

（收稿日期：2017-01-02）