色譜及其聯用技術在硒形態分析中的應用

廖美林++馬作江

摘要：硒是人體必需的微量元素，食品中的硒元素形態有多種，硒的化學形態可以影響人體補硒效果，硒形態分析研究具有重要意義。硒形態分析比傳統的硒總量分析復雜很多，本研究綜述了色譜及其聯用技術在硒形態分析中的應用，主要包括液相色譜、氣相色譜、毛細管電泳、離子色譜等光譜/質譜聯用技術，以期為硒形態的分析提供理論依據。

關鍵詞：硒；形態；色譜；聯用技術

中圖分類號：O657.7；O613.52 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）08-1413-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.003

Application of Chromatography and Related Hyphenated

Techniques of Selenium Speciation Analysis

LIAO Mei-lin， MA Zuo-jiang

（National Quality Supervision and Testing Center for Selenium Rich Products/Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture Center for Food and Drug Control， Enshi 445000， Hubei， China）

Abstract： Selenium is the essential trace elements for human body. There are many forms of selenium in food， and the effect of selenium supplement is determined by the selenium speciation， the research of speciation analysis of selenium is significance，Selenium speciation analysis is much more complex than the total content determination， the application of chromatography and related hyphenated techniques of selenium speciation analysis is reviewed， including liquid chromatography，gas chromatography，Ion Chromatography，capillary electrophoresis and related hyphenated with spectrometry/mass spectrometry. In order to provide a theoretical basis for the analysis of selenium speciation.

Key words： selenium； speciation； chromatography； hyphenated techniques

硒是人體必需的微量元素之一，硒的不同化學形態對人體的吸收、生物效應、毒性及防癌作用不同。許多日常食品中硒的可利用價值由硒的化學形態決定，硒形態主要分為無機硒和有機硒2種，無機硒的毒性大，而有機硒的毒性小。無機硒形態主要有HSe-、H2Se、金屬硒化物、硒酸鹽、亞硒酸鹽等，有機硒的形態主要包括甲基硒、二甲基硒、二甲基二硒等硒醚，硒代氨基酸，硒蛋白，硒多糖，硒核酸等，其中硒代氨基酸和硒蛋白是生物體內最主要的有機硒存在形態。由于硒形態復雜，硒形態分析比傳統的硒總量分析復雜很多。色譜分離及光譜/質譜檢測技術的發展，以及各種連接技術的陸續發現，為硒的形態分析提供了技術支持。目前硒形態研究主要以硒酸鹽、亞硒酸鹽、硒代氨基酸等小分子硒化合物為主。分析方法主要是利用液相色譜、氣相色譜、離子色譜、毛細管電泳及其聯用技術實現的。根據各種含硒化合物的不同性質，采用不同的色譜及其聯用技術進行分析。

1 硒形態的色譜聯用檢測技術

1.1 液相色譜及其聯用法

液相色譜（HPLC）法是目前應用最廣的色譜分離方法，與光譜或質譜技術等聯用可分離無機態物質、小分子代謝物、硒代氨基酸、含硒蛋白等多種物質，是目前硒形態分析的主流方法。主要有液相色譜法（HPLC）、液相色譜與原子熒光聯用法（HPLC-AFS）、液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用法（HPLC-ICP-MS）、液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS-MS/LC-TOF-MS）等。

1.1.1 液相色譜法 HPLC法在硒形態分析中，主要是對不同樣品的預處理方法、使用的衍生試劑、流動相和色譜條件等進行研究。潘紅陽等[1]優化了樣品預處理方法，并建立了柱前衍生反相高效液相色譜-紫外檢測富硒脫水菜心中硒代胱氨酸（SeCys）、硒甲基硒代半胱氨酸（SeMe-Cys）和硒代蛋氨酸（SeMet）的方法。劉建群等[2]采用柱前衍生-高效液相熒光法對硒營養強化奶粉中L-硒-甲基硒代半胱氨酸含量進行了檢測。李紅衛等[3]采用6 mol/L HCl溶液，50 ℃水解富硒米曲霉48 h，提取樣品中的有機硒，4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯柱前衍生，再利用高效液相色譜法對其有機硒形態進行了分析。

1.1.2 液相色譜-原子熒光光譜聯用法 原子熒光光譜（AFS）法在國內發展很快，是總硒含量測定的標準方法。但對于硒形態分析研究，多需要與色譜聯用，現在主要是與液相色譜聯用，國內已經有多款液相色譜-原子熒光光譜聯用儀器（形態分析儀），是由液相色譜與氫化物原子熒光聯用（HPLC-HG-AFS）的元素形態分析技術。能有效對硒、砷、汞等元素形態進行分離和檢測，該技術的優勢在于具備了液相分離的優點，能利用AFS的高靈敏度和元素特異性，儀器的整體價格也不高。肖志明等[4]建立了富硒酵母中Se（IV）、Se（VI）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒甲基硒代半胱氨酸（SeMeCys）4種硒形態的高效液相色譜-氫化物發生原子熒光光譜分析方法。尚德榮等[5]采用HPLC-HG-AFS法對水產品中硒的賦存形態檢測進行研究。韋昌金等[6]利用離子交換液相色譜-氫化物發生雙道原子熒光聯用法，同時測定了富硒營養品中的4種砷形態和3種硒形態。謝小雪等[7]建立了離子交換液相色譜-原子熒光聯用法同時測定水產品中硒代胱氨酸SeCys、硒代蛋氨酸SeMet和Se（VI）等3種硒形態的方法。HPLC-AFS法具有硒形態分離效果好、光譜干擾少、靈敏度高等特點，符合一般實驗室的檢測要求。

1.1.3 液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用法

電感偶合等離子體質譜法（ICP-MS）具有較寬的動態線性范圍，可以高效使待測樣原子化，能同時進行幾十個元素的定量測定，譜線簡單，干擾相對于光譜技術要少，既可用于元素分析，還可進行同位素組成的快速測定。這些特點使得它在元素形態分析中具有重要意義，由于液相色譜的流速和ICP-MS進樣速度一致，其聯用接口非常簡單。液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用（HPLC-ICP-MS）法是目前研究報道最多的元素形態分析方法。結合液相色譜的特點，具有進樣量小、分析速度快、分離效果好、檢出限低等優點。在各類食品中硒、砷、錫、汞等元素形態分析領域得到了越來越多的應用。王丙濤等[8]建立了高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用檢測食品中5種硒形態的方法。王欣等[9]建立了富硒食品中硒酸根（SeO42-）、亞硒酸根（SeO32-）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代胱氨酸（SeCys）、硒脲（SeUr）、硒代乙硫氨酸（SeEt）等6種硒形態的高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用檢測方法。Kapolna等[10]采用體積排阻色譜（SEC-HPLC）及離子對色譜（IP-RP-HPLC）與電感耦合等離子體質譜聯用法對富硒韭菜的硒形態進行了研究分析。

1.1.4 液相色譜-質譜聯用法 液相色譜-質譜聯用法主要包括液相色譜-串聯四級桿質譜法（LC-MS-MS）、液相色譜-飛行質譜聯用法（LC-TOF-MS），使該法具有靈敏度高、檢出限低、專一性強、分析速度快等優點，能有效排除樣品中大量基質的干擾，且能分析出硒同位素豐度光譜圖及其分子量信息，進行含硒化合物準確定性及定量分析。張明等[11]應用液相色譜串聯質譜法（LC-MS-MS）對富硒植物中的γ-谷氨酰胺-硒甲基-硒半胱氨酸（GSeMC）、硒甲基-硒半胱氨酸（SeMC）、硒胱氨酸（SeCys）和硒蛋氨酸（SeMet）等4種有機含硒化合物進行了快速篩查分析。鐵梅等[12]采用高效液相色譜-質譜聯用技術對富硒大豆可溶性蛋白中的硒代蛋氨酸進行了定性定量分析。肖強等[13]采用超高壓液相色譜-飛行時間質譜聯用（UPLC-TOF-MS）方法同時測定了硒蛋氨酸（SeMet）和硒胱氨酸（SeCys）含量。

1.2 氣相色譜及其聯用法

氣相色譜（GC）具有分辨率高、分析速度快、儀器設備消耗低等優點。可以直接分離檢測易揮發的甲基硒、二甲基硒等硒形態化合物，而無機的硒酸鹽、亞硒酸鹽以及硒代氨基酸等難揮發的硒化合物，必須通過氫化物發生、酯化和氨基的酰化或烷基化等試劑反應得到沸點較低的衍生產物才能用氣相色譜法實現分離檢測，且衍生化步驟使分離/分析過程復雜化，增加了待測硒形態丟失的可能性。陳曉霞等[14]通過異丙醇、七氟丁酸酐等試劑將對富硒丹參中的硒蛋氨酸衍生化反應后， 采用GC法進行了分析測定。氣相色譜分離多采用聯用技術對硒形態進行定性定量分析。Lee等[15]分別用GC法和GC-MS法使硒代氨基酸與其他氨基酸得到有效分離，并對西蘭花中的硒代氨基酸含量進行了分析。張浩等[16]采用氯甲酸乙酯衍生法，研究了硒氨基酸衍生物的一級質譜以及二級碰撞離子裂解規律，建立了硒蛋氨酸的GC-MS/MS測定方法，且對毛豆中的硒蛋氨酸含量進行了測定。段建坤[17]采用頂空吸附萃取-GC-ICP-MS法測定了洋蔥的揮發性有機硒化合物。

1.3 毛細管電泳及其聯用法

毛細管電泳（CE）以電滲流為驅動力、毛細管為分離通道，根據目標分子所帶電荷數與分子本身大小的比值進行分離，具有高分辨率、低檢測限等特點。王柏松等[18]以十二烷基三甲基溴化銨（CTAB）為電流改性劑對砷酸根和硒酸根進行了毛細管電泳分離。李平靜等[19]利用動態pH界面堆積毛細管電泳法對硒代氨基酸進行了分析。馮金榮等[20]設計了一種毛細管電泳氫化物發生裝置，利用該裝置將（CE）分離后的2種硒形態轉化為氫化物，通過CE-ICP-AES聯用對其檢測分析。Zhao[21]采用CE-ICP-MS聯用技術，對Se（IV）、Se（VI）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代胱氨酸（SeCys）等硒形態進行了分析檢測。毛細管電泳（CE）分離效率高，操作條件溫和，但是在分離過程中，樣品中硒形態可能由于電解質或pH的調節而發生變化，樣品的組成也是影響CE分離的一個重要因素，并且CE與ICP-MS的接口技術還不成熟。

1.4 離子色譜及其聯用法

離子色譜法（IC）作為一種有效的分離和檢測技術，已經在金屬和非金屬離子的測定中得到了較多應用，已成為解決復雜機體中超痕量硒形態分析的有效工具。秦冰等[22]采用離子色譜-積分脈沖安培檢測法（HPAEC-IPAD）對茶樹葉中硒代氨基酸進行定性和定量分析。林立等[23]采用離子色譜-電感耦合等離子體質譜法（IC-ICP-MS）測定了奶粉中的硒酸鹽[Se（VI）]、亞硒酸鹽[Se（IV）]、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒代胱氨酸（SeCys）等4種硒形態。

2 硒形態的色譜聯用鑒定技術

硒形態標準物質只有很少的幾種，加之硒在生物體內吸收和代謝過程的復雜性和多樣性，很難實現實際樣品中各種含硒未知形態的分析，所以需要多種聯用技術對其分子結構形態進行鑒定分析。王真真等[24]采用HPLC-MS/MS法，結合質譜數據庫比對以及HPLC-ICP/MS法，對富硒玉米蛋白的酶水解物中硒肽及含硒氨基酸的結構進行鑒定。結果確定了4種含硒氨基酸及5個硒小肽。劉瓊等[25]對微量含硒蛋白檢測技術進展進行了綜述，通過凝膠電泳與-電感耦合等離子體質譜（LA-ICP-MS）檢測含硒蛋白，用胰酶進行膠內酶解后，既可用毛細管高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜（Cap-HPLC-ICP-MS）或納升級高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜（Nano-HPLC-ICP-MS）檢測含硒多肽，也可用基質輔助激光解吸離子化-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）進行含硒蛋白的多肽質量指紋鑒定（PMF）和納升級高效液相色譜-電噴霧串聯質譜（Nano-HPLC-ESI-MS/MS）進行蛋白質識別和多肽序列測定。

3 小結

目前多種色譜聯用技術是硒形態分析的主流，HPLC與ICP-MS、AFS等的聯用是硒形態分析的主要方法，未知硒形態的結構鑒定中應用較多的是HPLC-MS-MS/TOF-MS等。硒形態分析難度較大，且有機硒具有多種形態，有些已經確認種類，但是也有一部分由于缺乏標準物質而無法確認，硒的形態分析方法的實用化和標準化是目前硒形態分析的瓶頸，這方面還要做大量的研究工作。

參考文獻：

[1] 潘紅陽，王樹英，莫海珍.反相高效液相色譜法測定富硒脫水菜心中的硒代氨基酸[J].食品與發酵工業，2008，34（10）：141-144.

[2] 劉建群，趙 元，舒積成，等.柱前衍生高效液相色譜熒光檢測法測定奶粉中L-硒-甲基硒代半胱氨酸[J].福建分析測試，2011， 20（4）：6-10.

[3] 李紅衛，王開萍，吳 娛，等.柱前衍生-反相高效液相色譜法檢測富硒米曲霉中有機硒形態[J].食品科學，2015，36（22）：137-141.

[4] 肖志明，宋 榮，賈 錚，等.液相色譜-氫化物原子熒光光譜法測定富硒酵母中硒的形態[J].分析化學，2014，42（9）：1314-1319.

[5] 尚德榮，秦德元，趙艷芳.高壓液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜（HPLC-HG-AFS）聯用技術檢測水產品中硒的賦存形態[J].食品安全質量檢測學報，2013，4（6）：1847-1852.

[6] 韋昌金，劉霽欣，裴曉華，等.離子交換色譜-氫化物發生雙道原子熒光法同時測定砷和硒形態[J].分析化學，2008，36（8）：1061-1065.

[7] 謝小雪，葉明德，陳丹飛，等.離子交換色譜-氫化物發生原子熒光法測定水產品中硒的形態[J].分析試驗室，2014（2）：241-243.

[8] 王丙濤，謝麗琪，林燕奎，等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用檢測食品中的五種硒形態[J].色譜，2011，29（3）：223-227.

[9] 王 欣，幸苑娜，陳 澤，等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法檢測富硒食品中6種硒形態[J].分析化學，2013，41（11）：1669-1674.

[10] KAPOLNA E，SHAH M，CARUSO J A，et al. Selenium speciationstudies in Se-enriched chives （Allium schoenoprasum） by HPLC-ICPMS[J]. Food Chemistry，2007，101（4）：1398-1406.

[11] 張 明，杜業剛，李衛東，等.LC-MS-MS快速篩查富硒植物四種有機硒方法應用研究[J].科學技術與工程，2006，6（8）：1052-1054.

[12] 鐵 梅，李寶瑞，邢志強，等.富硒大豆中蛋白提取工藝優化及HPLC-MS聯用測定硒代蛋氨酸[J].食品科學，2015，36（8）：6-11.

[13] 肖 強，秦 艷.UPLC-TOF-MS聯用快速測定硒蛋氨酸和硒胱氨酸[J].湖北民族學院學報（自然科學版），2014，32（3）：245-247.

[14] 陳曉霞，鄧仕任，夏林波.富硒丹參中硒氨基酸含量的測定[J].信陽師范學院學報（自然科學版），2010，23（1）：141-143.

[15] LEE J，FINLEY J W，HARNLY J M. Effect of selenium fertilizer on free amino acid composition of broccoli （Brassica oleracea Cv. Majestic） determined by gas chromatography with flame ionization and mass selective detection[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry，2005，53（23）：9105-9111.

[16] 張 浩，莫海珍，周全霞.氣相色譜串聯質譜法測定加工工藝對毛豆硒蛋氨酸含量的影響[J].食品科學，2010，31（14）：216-220.

[17] 段建坤，李 璇，禹春鶴.溶膠-凝膠涂層攪拌棒頂空吸附萃取GC-ICP-MS測定生物樣品中的揮發性有機硒化合物[A].湖北省化學化工學會第十一屆分析化學專業年會論文集，2007.

[18] 王柏松，萬俊生，丁富新，等.砷酸根和硒酸根的毛細管電泳分離[J].分析測試學報，2007，26（2）：187-190.

[19] 李平靜，鄭 菲，胡 斌，等.動態pH界面堆積毛細管電泳分析硒代氨基酸[A].中國化學會第26屆學術年會分析化學分會場論文集，2008.

[20] 馮金榮，孟 君，鄧必陽.毛細管電泳氫化物發生等離子體原子發射光譜聯用的接口設計[J].分析化學，2007，35（6）：861-864.

[21] ZHAO Y，ZHENG J，YANG M，et al.Speciation analysis of selenium in rice samples by using capillary electrophresis inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Talanta，2011，84：983-988

[22] 秦 冰，谷勛剛，王雅楠.外源硒肥對茶樹葉中硒代氨基酸形態及含量影響的研究[J].土壤通報，2013，44（4）：956-963.

[23] 林 立，孫海波，孫繼紅，等.離子色譜-電感耦合等離子體質譜法測定奶粉中的硒形態[J].理化檢驗（化學分冊），2015，44（4）：956-963.

[24] 王真真，張久亮，王 馳，等.富硒玉米蛋白水解物中硒肽及含硒氨基酸的結構鑒定[J].食品科學，2013，34（9）：1-4.

[25] 劉 瓊，彭 珍，梁雪瑩.微量含硒蛋白檢測技術進展[J].光譜與光譜學分析，2009，29（2）：530-535.