山黃皮果實和葉片揮發油成分分析

覃振師　賀鵬　王文林　張濤　宋海云　譚秋錦　湯秀華　許鵬　黃錫云　鄭樹芳　何銑揚　陳海生

摘要：[目的]考察山黃皮桂研15號果實（含果肉和果皮）和葉片揮發油化學成分差異，以挖掘山黃皮桂研15號的利用價值，為山黃皮資源的開發利用提供科學依據。[方法]采用水蒸汽蒸餾法提取山黃皮果實和葉片揮發油，通過氣相色譜一質譜聯用儀（GC-MS）對山黃皮不同部位揮發油化學成分進行分析；通過NIST標準質譜圖庫分別鑒定各化學組分；經面積歸一化法測定山黃皮不同部位揮發油中化學成分的相對含量。[結果]從山黃皮桂研15號果實和葉片中共鑒定出55種化合物，其中萜烯類28種、醇類4種、醛類6種、酮類2種、酯類4種、碳氫化合物類6種、醚類5種。從山黃皮果肉、果皮及葉片揮發油中分別鑒定出20、31和34種化合物，其相對含量占各自揮發油總量的76.97%、95.11%和83.85%。山黃皮果肉、果皮及葉片揮發油的主要成分分別為單萜類化合物β-蒎烯、月桂烯和萜品油烯。因此，山黃皮桂研15號果實和葉片揮發油化學成分以萜烯類化合物（主要是單萜類化合物）和醚類化合物為主。[結論]山黃皮桂研15號果實和葉片揮發油化學成分成分種類和含量存在明顯差異，且有獨特的揮發油成分。綜合成本因素，山黃皮桂研15號葉片揮發油具有更大的開發潛力。

關鍵詞：山黃皮；果實；葉片；化學成分；揮發油；氣相色譜-質譜法

0引言

[研究意義]山黃皮[Clausena anisum-olena（Blauco）Merr.]為蕓香科（Rutaceae）黃皮屬（Clausena）常綠多年生小喬木或大灌木，俗稱雞皮果，主要分布于我國廣西、云南和廣東等地，越南及菲律賓也有分布（黃峰等，2005）。山黃皮的果實味酸可口，香氣怡人，富含門冬氨酸、Y-氨基丁酸、丙氨酸等氨基酸（楊益林和黃艷，2011），具有助食消暑、祛痰化氣、消積消滯、疏通腸胃等功效，其葉可人藥，有引氣、健胃、止痛、消風腫、去疳積等功能。山黃皮揮發油對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、殺螟桿菌、大腸桿菌及枯草桿菌等有抑制作用（蘇秀芳等，2011a，2011b）。研究山黃皮果肉、果皮和葉片揮發油成分及其相對含量差異，對有效開發利用山黃皮具有重要意義。[前人研究進展]隨著人們對天然、綠色產品需求的日益增加，山黃皮產品市場空間越來越寬廣，有關其天然產物活性成分的研究逐漸成為熱點。Wang等（2008a，2008b，2009a，2009b，2010）運用植物化學手段，從山黃皮地上脂溶性部分中分離鑒定出1種新環八肽Clausenain B和7種新的單萜類香豆素。余燾等（2009）對廣西崇左中越邊境山黃皮葉片進行水蒸汽蒸餾，經GC-MS分析鑒定出山黃皮葉片揮發油中主要成分為（+）-4-蒈烯（45.67%）、2-甲基-2，6-叔丁基苯酚（40.84%）等。梁立娟等（2011）運用氣相色譜一質譜聯用儀（GC-MS）對水蒸汽蒸餾法提取的桂研20號果實揮發油進行成分分析，鑒定出其主要成分為（+）-4-蒈烯、肉豆蔻醚、異松油烯和（+）-檸檬烯等。蘇秀芳等（2011a）對廣西民族師范學院龍州校區院內景觀用品種山黃皮果仁以水蒸汽蒸餾，經GC-MS分析鑒定出其揮發油主要成分為4-甲氧基-6-（2-丙烯基）-1，3-亞甲二氧基苯（47.07%）等，且揮發油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及殺螟桿菌具有較強的抑制作用。蘇秀芳和梁振益（2011）對廣西扶綏縣野生品種山黃皮莖、根、葉、果實及花以水蒸汽蒸餾，經GC-MS分析鑒定出其共有的主要成分為4-甲氧基-6-（2-丙烯基）-1，3-苯并二嗯茂，在果實中含量為58.40%。Thaia等（2014）對越南諒山市山黃皮果實和葉片以水蒸汽蒸餾，經GC-MS分析鑒定出山黃皮果實和葉片揮發油中主要成分萜品油烯等占總峰面積的53%以上。You等（2015）研究發現山黃皮葉片揮發油中主要成分是肉豆蔻醚、萜品油烯、2-（4-甲基苯基）丙2-醇、3一蒈烯，其對常見糧倉害蟲煙草甲蟲（Lasioderma serricorne）和嗜卷書虱（Lipo scelis bostrychophila）成蟲具有較強排斥性。[本研究切入點]前人對山黃皮不同部位揮發油成分的研究主要集中在種植面積相對較少的景觀型及野生型品種上，目前有關主栽品種如山黃皮桂研15號等的揮發油成分分析研究報道較少。[擬解決的關鍵問題]采用GC-MS分析山黃皮桂研15號的果肉、果皮及葉片揮發油成分，為開發山黃皮資源開發利用提供科學依據，以期開發出山黃皮系列產品，延長產業鏈，提高果農收入。

1材料與方法

1.1試驗材料

以廣西南亞熱帶農業科學研究所選育的山黃皮品種桂研15號為材料。選取5株長勢、樹形相似的成年結果果樹，從每株果樹樹冠的東、西、南、北4個方向采摘處于同一成熟度的成熟果實5個、顏色相近的葉片10片，各自混合帶回實驗室，置于20℃冰箱冷藏。主要儀器設備：GC-MS（美國Thermo Electron FinniganTrace DSQ公司）、電子天平（型號BTl24S，賽多利斯公司）。試劑：NaCl、無水硫酸鈉（分析純，成都市科龍化工試劑廠）、超純水（自制）。

1.2試驗方法

1.2.1預處理 將成熟期山黃皮果實的果肉與果皮分離，果肉均勻漿，果皮和葉片均切成0.5 cm×0.5cm的小塊，搗碎。

1.2.2蒸餾提取方法 準確稱量樣品150.0 g，置于1000 mL圓底燒瓶中，加入0.6%NaCl溶液，搖勻，冷凝回流。自冷凝管上端加無離子水充滿揮發油測定器的刻度部分，并溢流人燒瓶時為止。測定器置電熱套中微沸4 h，停止加熱，靜置片刻，將水緩緩放出，放出香精油，經無水硫酸鈉干燥后，用適量正已烷溶解，過0.22 m有機濾膜，用于GC-MS分析。試驗重復3次。

1.2.3 GC-MS分析條件

1.2.3.1色譜條件 DB-5MS 5%苯基甲基聚硅氧烷毛細管柱（30.00 mx0.25 mm，0.25 m）。載氣為高純度氦氣（>99.999%），流速1.0 mL/min，進樣口溫度250℃。柱溫采用升溫程序：60℃保持1 min，以5℃/min升溫至280℃，保持10-min。進樣量0.5uL，分流比100：1，溶劑延遲1 min，恒流模式進樣。

1.2.3.2質譜條件 電離方式：EI源，電離能量70eV，離子源溫度203℃，傳輸線溫度280℃。其他參數為標準自動調諧參數。質量掃描范圍：30-600 m/z。

1.2.4檢索方式 儀器自動檢測索，依據為NIST標準質譜圖庫。對譜庫中化合物匹配程度（O）低于80（最大值為100）的組分標為未鑒定出。采用峰面積歸一法計算各成分的相對含量，即計算各峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。

1.3統計分析

試驗數據采用Excel 2003進行整理及分析。

2結果與分析

2.1山黃皮果實和葉片的揮發油成分組成及其含量分析

由表1和表2可知，從山黃皮果實和葉片中共鑒定出55種化合物，其中萜烯類28種、醇類4種、醛類6種、酮類2種、酯類4種、碳氫化合物類6種、醚類5種。果肉與果皮共有的化合物有13種，分別是9種萜烯類、1種碳氫化合物類和3種醚類。果實（含果肉和果皮）與葉片共有的化合物有11種，分別為8種萜烯類（蒎烯、b-trans-ocimene、（z）-3，7-二甲基-1，3，6-十八烷三烯、萜品烯、萜品油烯、y-pyronene、1-石竹烯、l-b-紅沒藥烯）和3種醚類（丁香酚甲醚、肉豆蔻醚、欖香素）。由表2可知，山黃皮桂研15號果肉中鑒定出20種揮發油成分，占總峰面積的76.97%。其中，萜烯類13種，含量最高，占總峰面積的66.10%；其次為醚類3種，占總峰面積的10.22%；僅存在于果肉揮發油中的化合物有4種，分別為3，7-二甲基-1，3，7-辛三烯、Germacrene B、壬醛和2，4-二甲基苯乙烯。從果皮中鑒定出31種揮發油成分，占總峰面積的95.11%。其中，萜烯類19種，含量最高，占總峰面積的78.53%；其次為醚類5種，占總峰面積的15.71%；僅存在于果皮揮發油中的化合物有13種，分別為Sabenene、皮蠅磷、月桂烯、（+）-香橙烯、b-cis-famesene、Leden、3，7，11，11-tetramethylbicyclo[8.1.0]2，6-u-ecadiene、1-壬醇、Myrtanol、橙花醇、（E）-3，7-二甲基-2，6-辛二烯醛、胡椒酮和Perillene。從葉片中鑒定出34種揮發油成分，占總峰面積的83.85%。其中，萜烯類18種，含量最高，占總峰面積的74.99%；其次為醚類3種，占總峰面積的4.22%；僅存在于葉揮發油中的化合物有17種，分別為a-ylangene、a-石竹烯、（+）-a-elemene、（-）-b-cadinene、y-欖香烯、苯乙醇、2-己烯醛、（E，E）-2，4-己二烯醛、苯甲醛、反-2，6-壬二醛、對甲基苯乙酮、2-己烯酸甲酯、水楊酸甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、4-異丙基甲苯和十八烷。綜上所述，山黃皮不同部位揮發油成分中的化合物種類及其相對含量間均存在明顯差異。

2.2山黃皮果實和葉片揮發油成分的主要組分及其相對含量分析

由表1和表2可知，山黃皮不同部位揮發油成分化合物中醇類、醛類、酮類、酯類和碳氫化合物及其相對含量較少，其主要成分是萜烯類化合物（尤其是單萜類化合物）和醚類化合物。山黃皮果肉揮發油組分的單萜烯類化合物B-蒎烯（FEMA編號2903）（表1）相對含量最高，其次為醚類化合物肉豆蔻醚及萜烯類化合物萜品油烯、3-蒈烯和l-b-紅沒藥烯，其中，單萜類化合物相對含量總和占62.96%。B-蒎烯因具有多種潛在的生物活性而受到廣泛關注（廖圣良等，2016），富含B-蒎烯的植物精油具有抗氧化（Kelen and Tepe，2008；Banday，2014）、殺菌（Kelenand Tepe，2008）、消炎（Woguem et a1.，2014）、抗腫瘤（Abdel-Hameed et a1.，2014）等活性，GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》批準其為允許使用的食用香料，編號S0659，目前主要生產方式是從松節油中單離出（林翔云，2007）。

山黃皮果皮揮發油組分的單萜烯類化合物月桂烯相對含量最高，其次為醚類化合物肉豆蔻醚及萜烯類化合物萜品油烯、l-b-紅沒藥烯、1-石竹烯、3-蒈烯；山黃皮果皮中主要成分為單萜類化合物月桂烯（FEMA編號2762）（表1），用于番木瓜、芒果、香檸檬、橙及果汁混合甜飲料等香型配制（林翔云，2007），GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》將其批準為允許使用的食用香料，編號S0653，也可用于合成1-薄荷醇、香茅醛、新鈴蘭醛和龍涎酮等香料（楊陽等，2012）。

山黃皮葉片揮發油組分的單萜烯類化合物萜品油烯相對含量最高，其次為醚類化合物地肉豆蔻醚及萜烯類化合物1-石竹烯、a-萜品烯、1-b-紅沒藥烯、B-蒎烯和醛類2-己烯醛。在山黃皮果肉、果皮和葉片揮發油中相對含量超過50.00%的萜烯類化合物分別為B-蒎烯（50.22%）、月桂烯（53.33%）和萜品油烯（55.37%），其單萜類化合物相對含量總和分別占62.96%、70.80%和64.99%，山黃皮葉片中主要成分單萜類化合物萜品油烯（FEMA編號3046）（表1）具有檸檬氣味，也是生產合成香料的重要原料。

因此，山黃皮揮發油成分的主要組分為萜烯類化合物（主要是單萜類化合物）和醚類化合物。

3討論

3.1山黃皮果實和葉片的揮發油成分比較

本研究從山黃皮桂研15號果實和葉片中共鑒定出55種化合物，其中萜烯類29種、醇類4種、醛類6種、酮類2種、酯類4種、碳氫化合物類6種、醚類5種；從果肉中鑒定出20種揮發油成分，從果皮中鑒定出31種揮發油成分，從葉片中鑒定出35種揮發油成分。果肉、果皮及葉片揮發油中共有的化合物有11種，分別為8種萜烯類（蒎烯、b-trans-ocimene、（z）-3，7-二甲基-1，3，6-十八烷三烯、萜品烯、萜品油烯、Y-pyronene、1-石竹烯和1-b-紅沒藥烯）和3種醚類（丁香酚甲醚、肉豆蔻醚、欖香素）；而共有的化合物分別占果肉、果皮和葉揮發油含量的23.36%、37.66%和69.59%。其中，僅存在于果肉揮發油中的化合物有4種，其相對含量為1.02%；僅存在于果皮揮發油中的化合物有13種，其相對含量為55.75%；僅存在于葉片揮發油中的化合物有17種，其相對含量為6.75%。本研究中山黃皮桂研15號果肉揮發油成分及其相對含量與梁立娟等（2011）研究得出的山黃皮桂研20號揮發油成分及其相對含量不同，與蘇秀芳等（2011b）報道的龍州產山黃皮變種細葉黃皮果實果肉揮發油成分及其相對含量也不同。梁立娟等（2011）研究發現，桂研20號果實果肉揮發油中相對含量較高的有肉豆蔻醚（64.85%）、（+）-4-檸檬酸（12.25%）等，其果皮揮發油中相對含量較高的有（+）-4-蒈烯（62.6%）、肉豆蔻醚（20.28%）等；蘇秀芳等（2011b）研究發現，龍州產山黃皮變種細葉黃皮果實果肉揮發油中相對含量較高的有4-甲氧基-6-（2-丙烯基）-1，3-亞甲二氧基苯（47.07%）等。本研究結果與Molino（2000）不同，未鑒定出（E）-茴香腦和甲基胡椒酚；與蘇秀芳和梁振益（2011）報道的也不同，未分離鑒定出山黃皮變種細葉黃皮莖、根、葉、果實及花揮發油的共有化合物為4-甲氧基-6-（2-丙烯基）-1，3-苯并二惡茂。在本研究中，桂研15號的葉片揮發油組分與余燾等（2009）研究結果相似，以萜品油烯（53.89%）含量最高，其次為肉豆蔻醚、3-蒈烯、B-月桂烯、（+）-4-蒈烯、芋烯、a-水芹烯、B-紅沒藥烯和a-蒎烯等；鑒定出的化合物以單萜化合物為主，與Thaia等（2014）研究結果一致。其主要原因是提取的揮發油是一種混合物，其化學成分組成和相對含量受到植物品種、組織部位、生長環境、提取方法及采樣時間等因素影響。

3.2山黃皮桂研15號揮發油的開發應用前景

本研究中山黃皮果實和葉片揮發油成分中共有的化合物相對含量較高的為醚類化合物肉豆蔻醚，但其具有毒性（陳宏降等，2011）、致幻作用（黃鑫和楊家偉，2007）、抗肝臟脂質過氧化作用（zheng et al.，1992）和癌癥預防作用（Hattori et al.，1993）。果實和葉片揮發油化學成分種類和含量差異明顯，果肉揮發油成分中B-蒎烯的相對含量達50.22%，果皮揮發油成分中月桂烯相對含量達53.33%，葉片揮發油成分中萜品油烯相對含量達55.37%。由此可見，山黃皮桂研15號果實可作為制作香料香精B-蒎烯和月桂烯的原料，葉片可作為制作單離萜品油烯的原料。另外，山黃皮果實揮發油主要成分B-蒎烯和月桂烯的基本特征與山黃皮果實具有令人愉快的、清淡的香脂氣味揮發油類似，葉片揮發油主要成分萜品油烯的基本特征與山黃皮葉具有刺激性氣味、同時兼具檸檬和樹脂揮發油類似，由此可推斷山黃皮果實揮發油主要是B-蒎烯和月桂烯的共同作用結果，而葉片揮發油主要是萜品油烯作用的結果。由于B-蒎烯、月桂烯和萜品油烯在山黃皮桂研15號不同部位揮發油中含量比例均較高，可作為香精香料及其原料予以開發，但綜合成本因素，山黃皮桂研15號葉片揮發油具有更大的開發潛力。

4結論

山黃皮桂研15號果實及其葉片部位揮發油化學成分成分種類和相對含量存在明顯差異，且有獨特的揮發油成分。綜合成本因素，山黃皮桂研15號葉片揮發油具有更大的開發潛力。