一株粘細菌Myxococcus sp. STXZ90的分離鑒定及生物活性分析

黃同龍++雷良歡++廖繼燕++周偲++吳雨婧++李純++魏慧++夏立秋++丁學知++張友明

DOI：10.7612/j.issn.10002537.2017.02.004

摘要采用滅活大腸桿菌誘導法分離粘細菌，通過形態觀察、生理生化實驗、16S rRNA基因序列同源性分析，對其進行鑒定并歸類.并通過平板對峙法、腫瘤細胞毒性實驗等檢測粘細菌代謝產物的抑菌和抗腫瘤活性，RPHPLC分離抗腫瘤活性物質.分離得到一株粘細菌，鑒定結果表明該菌株為黃色粘球菌，將其命名為Myxococcus sp. STXZ90（簡寫為STXZ90）.抑菌試驗表明，STXZ90對多種人類病原菌及魚類致病細菌如產氣腸桿菌、嗜水氣單胞菌等具有較高的抑制活性；STXZ90發酵上清的甲醇粗提物對多種腫瘤細胞具有廣譜高效的抑制腫瘤細胞活性，對Hep3B，Hela和HUVEC等的最低半抑制濃度（IC50）為0.279～1.228 mg/L.對該甲醇粗提物進行RPHPLC分離，得到2個較純的單峰物質，體外腫瘤細胞實驗結果顯示該組分有較強的抑制腫瘤細胞活性.

關鍵詞粘細菌；次級代謝產物；高效液相色譜

中圖分類號Q939文獻標識碼A文章編號10002537（2017）02002508

On Isolation， Identification and Bioactivitiy of Myxococcus sp. STXZ90

HUANG Tonglong， LEI Lianghuan， LIAO Jiyan， ZHOU Cai， WU Yujing，

LI Chun， WEI Hui， XIA Liqiu， DING Xuezhi， ZHANG Youming*

（State Key Laboratory Breeding Base of Microbial Molecular Biology， College of Life Science， Hunan Normal University， Changsha 410081， China）

AbstractThe inactivated Escherichia. colidependent fruiting baiting technique was used to isolate myxobacterial strains. Based on the phylogenetical characteristics， physiological and biochemical properties and 16S rRNA gene sequence homology analysis， the isolated strain has been identified and classified. The inhabitation of the strain to different pathogens and tumor cells were detected by the Plate Confrontation Culture Method and tumor cell toxicity experiment. The antitumor substance was further purified by RPHPLC. Our results showed that the strain belonged to myxococcus xanthus and thus it was named as Myxococcus sp. STXZ90（STXZ90）. The antibacterial experiment indicated that STXZ90 had bacteriostatic activity to different human pathogens and fish pathogens， such as Enterobacter aerogenes， and Aeromonas hydrophil. The methanol elution of the fermented supernatant of STXZ90 exhibited a broad spectrum and high effect on various tumor cell lines. The IC50（half maximal inhibitory concentration） to Hep3B，Hela， and HUVEC were between 0.279 to 1.228 mg/L. The methanol elution was further purified by RPHPLC with 2 single peak fragments obtained， which displayed strong inhibitory activities to cancer cells.

Key wordsMyxobacteria； secondary metabolite； HPLC

粘細菌（myxobacteria）是土壤中較為常見的一類單細胞革蘭氏陰性細菌，營養細胞桿狀，具有復雜的多細胞行為，可以滑行運動，能產生結構各異、種類多樣、活性高效的次級代謝產物，在農業、醫藥、生態環境等方面具有重要的研究應用價值[19].

據Dawid報道，在2 000多株溶細菌的粘細菌中，有55%能產生生物活性物質；在700多株溶纖維素的粘細菌中，有95%可產生生物活性物質[10].安布替星（ambruticin）是粘細菌來源的第一個確定化合物結構的生物活性物質，分離自纖維堆囊菌（Sorangium cellulosum）的次級代謝產物，具有抗真菌作用，可用于麻醉藥及其輔助用藥[11].抗生素TA是1973由Rosenberg等[12]從粘細菌中分離得到的第一個抗生素，來自橙色粘球菌（Myxococcus fulvus）的次級代謝產物.纖維堆囊菌產生的epothilons是與紫杉醇具有相同作用機制的十六元聚酮大環內酯化合物，是一種很好的抗癌新藥，對乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等都有很好的抑制效果，且IC50（最低半抑制濃度）都在納摩爾水平[13]. 粘細菌的次級代謝產物種類豐富，大部分具有抑菌、抗腫瘤活性，是新型生物活性物質的來源[1415].本研究對分離純化的粘細菌進行形態觀察、菌種鑒定分類歸屬，豐富了粘細菌菌種資源，同時為今后粘細菌的分離純化和次級代謝產物中新型活性物質的篩選打下良好基礎.

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土樣通過多點取樣法從湖南益陽菜地采集得到.

1.1.2供試菌株人類病原細菌產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色念球菌（Monilia albican）及魚類致病細菌嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda），均由本實驗室保藏.

1.1.3供試細胞株小鼠黑色素腫瘤細胞（B16）、人肝癌細胞（SMMC7721）、小鼠乳腺癌細胞（4T1）、人類宮頸癌細胞（HeLa）、人類肝癌細胞（Hep3B）、人結直腸癌細胞（SW480）、人正常細胞臍靜脈上皮細胞（HUVEC），均由本實驗室保藏.

1.1.4培養基WAX固體培養基（CaCl2·2H2O 1 g， HEPES 0.5 g， Agar 15 g，H2O 1 000 mL，pH 7.2）；MD1液體培養基（Casein Peptone 6 g，Starch 2 g，MgSO4·7H2O 2 g，CaCl2·2H2O 0.4 g，H2O 1 000 mL，pH 72）；LB液體培養基（Tryptone 10 g，Yeast extract 5 g，NaCl 10 g，H2O 1 000 mL）；CTT固體培養基（Casein Peptone 10 g， MgSO4·7H2O 1.97 g， KH2PO4/K2HPO4 Buffer（pH 7.6） 1 mmol/L， Tris·HCl Buffer（pH 7.6） 10 mmol/L， Agar 15 g， H2O 1 000 mL， pH 7.6）.

1.2粘細菌的分離

1.2.1土樣的預處理采集土樣，風干研磨，過篩，稱取土樣3 g，加入到2 mL抗生素混合液中（慶大霉素30 g/L，卡那霉素8 g/L，氨芐青霉素30 g/L），再加入15 g/L的放線菌酮1 mL，55℃水浴10 min，放置過夜，在分離前再55 ℃水浴10 min[16].

1.2.2滅活大腸桿菌誘導法離心收集大腸桿菌，高溫滅菌，再將大腸桿菌糊用剪尖的藍色槍頭滴加在WAX平板上（WAX平板已加入25 mg/L放線菌酮），將處理后的土樣滴加在滅活大腸桿菌旁，30 ℃培養3 d后開始觀察子實體形成情況.

1.2.3粘細菌的純化大腸桿菌有被蝕刻的痕跡、且長出粘細菌子實體時，在體式顯微鏡下，反復多次將子實體轉接到新的WAX平板上，直至LB液體培養基驗純培養時，培養過夜后粘細菌呈塊狀或薄膜狀，而培養液澄清，此時，則認為已獲得純培養，然后將純化的粘細菌轉接到MD1液體培養基中，30 ℃，150 r/min，培養7 d，25%甘油保藏，置于 -80 ℃冷凍保藏.

1.3菌株鑒定

1.3.1形態觀察將分離純化得到的粘細菌接于WAX平板上，30 ℃培養7 d后，體式顯微鏡下觀察菌落及子實體形態.并將該菌接到MD1液體培養基中培養7 d后，取菌體進行革蘭氏染色，在普通光學顯微鏡下觀察.并取菌體在掃描電鏡下觀察其營養細胞形態.

1.3.2生理生化特征觀察參照《常見細菌系統鑒定手冊》[17]和Lyudmila（2000）[18]等的方法進行.

1.3.316S rRNA基因擴增、測序與構建系統發育樹參照文獻[16]中的方法進行.

1.4STXZ90菌株生長曲線的測定及其在不同生長時期的抗腫瘤活性

1.4.1STXZ90菌株生長曲線的測定本研究采用稱重法測粘細菌的生長量：從平板上將粘細菌轉接到MD1液體培養基中，30 ℃搖床，擴大培養4 d，然后將其轉接到500 mL裝有玻璃珠和MD1液體培養基的搖瓶中，搖床培養3 d后，按5%的接種量將其轉接至30個搖瓶中，每隔12 h取一瓶離心收集菌體，去掉表面水分，稱取并記錄質量.

1.4.2STXZ90菌株不同生長時期的抗腫瘤活性測定取遲緩期、對數期、穩定期和衰亡期的發酵上清各1 mL，過濾除菌后，取10 μL檢測其細胞毒性，同時取MD1液體培養基10 μL作為對照，發酵上清和對照各做3 個平行.培養24 h后，觀察細胞形態變化.

1.5STXZ90菌株的抑菌活性

采用平板對峙培養法（Plate Confrontation Culture Method），檢測STXZ90對供試人類病原細菌產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色念球菌（Monilia albican）及魚類致病細菌嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）的抑菌效果.粘細菌在MD1液體培養基中培養7 d左右至含有大量成團菌體時，用槍頭打散菌體后，取1 mL菌體，均勻涂布于CTT固體平板上，30 ℃恒溫倒置培養7 d左右至子實體長出.取各受試菌的菌保液在LB固體培養基平板上稀釋劃線，30 ℃恒溫培養12～24 h，分別轉接到裝有1.4 mL LB液體培養基的1.5 mL EP管中，在管蓋上用注射器針頭扎小孔，37 ℃，1 000 r/min，振蕩培養12 h，各取100 μL，用涂布器均勻涂抹于CTT固體培養基平板上，待平板吹干后，用藍色槍頭扎取培養平板上的STXZ90菌株，將其倒扣在涂布好的指示菌平板上，用同樣的方法扎取CTT固體培養基做對照，每組3個平行，30 ℃恒溫倒置培養6 d[19].

1.6STXZ90菌株抗腫瘤活性物質的分離純化

1.6.1XAD16樹脂吸附STXZ90菌株于MD1液體培養基中發酵7 d后，取發酵上清液300 mL，12 000 r/min離心去菌體，取6 mL XAD16樹脂濕熱滅菌后，加入粘細菌發酵上清液中，轉入500 mL大搖瓶，在30 ℃搖床內，轉速100 r/min，使活性物質被充分吸附，放置2～3 d.

1.6.2XAD16樹脂洗脫用濾紙過濾得樹脂，加入10倍原始上清液的無菌水洗滌樹脂后，用10倍樹脂體積的甲醇對樹脂進行洗脫，除菌后進行多種細胞的毒性實驗，檢測其活性，并用MTT法檢測其對多種細胞的抑制率并計算IC50.

1.6.3甲醇粗提物的RPHPLC分析抽濾色譜純乙腈和水作流動相溶液，在安捷倫1290上進行C18柱反相高效液相色譜，檢測甲醇粗提物，根據色譜分離峰圖譜來判斷粗提物的物質復雜程度.對分離較好的峰進行反復收集，再進行腫瘤細胞毒性試驗，檢測其抗腫瘤活性.

2結果

2.1菌株鑒定

2.1.1形態特征從圖1可以看出，STXZ90培養液呈黃色，在WAX平板上表現出運動性，能蝕刻大腸桿菌，子實體由中心向四周輻射狀展開，子實體周圍有透明的液體，菌落粘稠難挑取，革蘭氏染色呈陰性，掃描電鏡顯示細胞呈細長桿狀，細胞末端呈略尖的錐形，細胞大小約為4.0 μm×0.7 μm，無鞭毛.

2.1.2生理生化特征STXZ90生理生化實驗結果見表1，與伯杰細菌鑒定手冊中粘細菌特性相符合.

2.1.3系統發育樹的構建STXZ90的16S rRNA 基因序列長度為1 602 bp，在NCBI上經過BLAST分析，結果表明該菌株屬于粘球菌屬，與Myxococcus sp. XAC 03有最高相似性，同源性為99%，但STXZ90在系統進化樹上與各亞種分開形成新的分支，不與Myxococcus sp. XAC 03屬于同一亞種，結合16S rRNA序列分析和菌株的形態及生理生化結果，將STXZ90命名為Myxococcus sp. STXZ90.利用MEGA 6的Kimura2Parameter模型，運用鄰接法（NJ）構建的系統發育樹如圖2所示.

2.2STXZ90菌株在不同生長時期代謝產物的抗腫瘤活性利用稱重法測定STXZ90的生長曲線，并取其4個生長時期，即遲緩期（12 h）、對數期（36 h）、穩定期（96 h）和衰亡期（240 h）的發酵上清，檢測其細胞毒性.該菌在接種后便迅速調整進入對數生長期，在72 h菌體質量達到最大，進入穩定期，但其穩定期在整個細胞周期中占比少，時間只有對數期的一半，在108 h即進入衰亡期，菌體數量開始減少，如圖3所示.細胞進入衰亡期后生物量減少，說明衰亡期細胞可能發生裂解或營養細胞形成抵御不良環境的粘孢子.

圖4顯示了不同生長時期的STXZ90發酵上清對小鼠黑色素瘤細胞B16的增殖抑制效應，從圖中可知，在STXZ90對數期，即12 h時，其發酵上清就顯示了一定程度的抑制效應，隨著時間增長，36 h和96 h時抑制效應也相應增強，這說明在對數期STXZ90產生的抗腫瘤細胞活性物質逐漸積累，從對數期持續到穩定期.進入穩定期（96 h）后，抗腫瘤活性物質可能并未繼續積累，圖4顯示240 h抗腫瘤活性并未明顯高于96 h，說明活性物質的積累主要在對數期或穩定期，可能是活性物質合成的代謝途徑受到反饋抑制.后期擬通過改變培養條件或采用分子克隆手段突變代謝途徑中的某些堿基來增加活性物質的產量.

2.3STXZ90菌株的抑菌活性

如圖5～6所示，以平板上接種的STXZ90為中心出現的透明圈顯示了STXZ90對5種受試人類致病細菌和4種魚類致病細菌的抑菌活性，透明圈的大小顯示出STXZ90對不同致病細菌的抑制效果有明顯的差異性，其對產氣腸桿菌Enterobacter aerogenes、鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium、普通變形桿菌Proteus vulgaris、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、白色念球菌Monilia albican、嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila、維氏氣單胞菌Aeromonas veronii、豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviae、遲緩愛德華氏菌Edwardsiella tarda具有高效的抑制活性.STXZ90對多種人類致病菌和魚類致病菌具有抑制作用，說明STXZ90具有開發抗菌藥物的價值，同時對于魚類疾病的防治也具有重要意義.

2.4STXZ90菌株抗腫瘤活性物質的分離純化

將甲醇洗脫物配置成不同濃度梯度，分析其對不同腫瘤細胞毒力大小，以測其對多種細胞的半致死濃度.濃度為1.33 mg/L的甲醇洗脫物能很好地抑制多種腫瘤細胞，且對正常細胞HUVEC作用效果比較弱（見圖7）.在此濃度下，該粗提物對Hep3B，Hela，SMMC7721，B16，4T1，SW480和HUVEC的抑制率分別為：90.06%，85.42%，88.10%，89.88%，86.34%，65.34%和34.94%（如圖8）.利用SPSS 13.0軟件統計分析該粗提物對各腫瘤細胞最低半抑制濃度（IC50），其對Hep3B，Hela，SMMC7721，B16，4T1，SW480和HUVEC的最低半抑制濃度分別為：0.328，0.454，0.279，0.453，0.633，0.926和1.228 mg/L（表2）.本文結果顯示STXZ90的發酵粗提物表現出廣譜高效的抗腫瘤活性，對發酵粗提物中活性物質進行分離純化并找到活性最高組分具有重要意義.

對甲醇洗脫物進行C18柱反相高效液相色譜分析，見圖9.收集分離的各個單峰，冷凍干燥去除色譜流動相后，進行腫瘤細胞毒性實驗.如圖10所示，保留時間分別為12.920和13.804 min的單峰物質對B16細胞有細胞毒性，其中保留時間為13.804 min的峰物質活性最高且峰型對稱（圖10c），說明此物質較純.與加甲醇對照組相比，活性組分作用后腫瘤細胞數量明顯減少，且倒置顯微鏡觀察發現其不能保持貼壁形態，細胞形態不飽滿，兩端出現抽絲且變圓.

3討論

粘細菌在土壤中比較常見，但由于粘細菌很難由單個的細胞形成單克隆，且代時較長，易于夾雜其他細菌、真菌、阿米巴和線蟲等特點，給粘細菌的分離和純化帶來極大困難.因此，粘細菌和一般細菌的分離純化不同.一般情況下，得到一株純的溶菌群類的粘細菌菌株需要幾個月的時間，而某些纖維素類的粘細菌耗時更長，常需 1～2 年的時間[20].為提高粘細菌篩選效率，利用現代分子技術建立新篩選模型成為粘細菌分離純化的研究熱點.如蔣德明等[21]利用分子生物學技術來分析海底粘細菌的多樣性，建立基因庫；高秀珍[22]利用微包埋技術，獲得粘細菌的單克隆，提高了純化的效率.但由于各種條件的限制，這些分離純化方法的適用范圍并不廣.本實驗采用大腸桿菌誘導子實體法，從土壤中分離得到粘細菌STXZ90，屬于粘球菌屬[23].本文的抑菌實驗表明，STXZ90對多種人類病原菌及魚類病原菌如產氣腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌等都有較高的抑制活性.作者推測STXZ90的抑菌功能與其產生水解酶的功能有關.已有研究發現，粘細菌在營養條件缺乏時能通過產生水解酶降解多種細菌提供營養供自身生長所需，如Hillesland等[24]發現粘球菌能在共培養時降解Escherichia coli， Corynebacterium glutamicum， Micrococcusluteus，Saccharomyces cerevisiae等多種細菌.近年來從粘球菌中分離得到多種抗腫瘤活性物質，如3Omethylmyxochelin A[15]及Myxothiazol[25]等.本研究中細胞毒性實驗表明，STXZ90的甲醇粗提物對Hep3B，Hela，SMMC7721，B16，4T1，SW480和HUVEC的最低半抑制濃度分別為：0.328，0.454，0.279，0.453，0.633，0.926和1.228 mg/L.將STXZ90的甲醇粗提物進行RPHPLC分析，得到2個單峰物質，均顯示了不同程度的B16腫瘤細胞毒性，其保留時間分別為12.920和13.804 min，其中保留時間為13804 min的峰物質活力最高且最純凈.具有抗菌和抗腫瘤活性的粘細菌新菌株STXZ90的發現，豐富了微生物藥用菌種資源庫，也為藥物先導分子的研發進行了初步探索.

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（編輯WJ）