促肝細胞生長素對百草枯中毒引起大鼠急性肺損傷的影響

顏麗萍++凌順++李弘++喻曉東++蘇林++石曉萍++陳依鴿++閆玉棟

[摘要] 目的 研究促肝細胞生長素（pHGF）對急性百草枯中毒大鼠肺組織凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達及血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平的影響。 方法 將90只SD大鼠按照隨機數字表法隨機分為三組：非藥物處理組，毒素處理組，治療組，各組30只。毒素處理組、治療組均以PQ（25 mg/kg）一次性腹腔注射染毒，治療組予每天1次pHGF（50 μg/kg）腹腔注射，持續至第7天。各組于注射后第1、3、7天時間點處死相同數目大鼠，觀察各組病理學變化，并收集血清及肺組織用于相關指標的檢測分析。 結果 與非藥物處理組比較，毒素處理組各時間點動脈氧分壓（PaO2）均有不同程度下降，治療組第1、3天相比毒素處理組PaO2有所改善（P < 0.05），第7天與毒素處理組比較，PaO2改善不明顯（P > 0.05）；毒素處理組較非藥物處理組肺組織Bax、Bcl-2蛋白表達及血清TNF-α水平明顯增高（P < 0.01），而血清超氧化物歧化酶（SOD）活力明顯降低（P < 0.01）；各時間點治療組較毒素處理組肺組織中Bax蛋白表達及血清TNF-α水平降低（P < 0.05），Bcl-2蛋白表達水平及血清SOD活力升高（P < 0.05）。 結論 pHGF對百草枯中毒大鼠急性肺損傷具有保護作用，其機制可能通過降低炎性反應、減少氧化損傷、抑制細胞凋亡來減輕肺損傷程度。

[關鍵詞] 促肝細胞生長素；百草枯中毒；肺；細胞凋亡；凋亡相關蛋白

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（c）-0029-04

[Abstract] Objective To observe the effect of hepatocyte growth-promoting factor （pHGF） on the protein expression of Bcl-2 and Bax in lung tissue and serum tumor necrosis factor α （TNF-α） level in acute paraquat poisoning rats. Methods According to random number table， 90 SD rats were randomly divided into three groups： non drug treated group， venoms group， treatment group， with 30 rats in each group. The venoms groups and treatment group were treated with PQ （25 mg/kg） by a single intraperitoneal injection， treatment group was given pHGF （50 μg/kg） by intraperitoneal injection， once a day， for seventh days. A same number of the rats were sacrificed at the 1st day， 3rd day and 7th day， and the pathology change and the related indexes of each group in serum and lung tissue were observed. Results Compared with non drug treated group， PaO2 of the venoms group was decreased inordinately at each time point. Compared to poisoning group， the PaO2 of treatment group was improved at the 1st and 3rd day （P < 0.05）， the seventh day had no obvious change （P > 0. 05）. Compared with non drug treated group， the protein expression of Bcl-2 and Bax in lung tissue and serum TNF-α level in venoms group were significantly increased （P < 0.01）， whereas，the serum SOD activity was decreased obviously （P < 0.01）. Compared with poisoning group， Bax protein expression in lung tissue and serum TNF-α level were decreased （P < 0.05） and Bcl-2 protein expression and serum SOD activity were increased （P < 0.05） in treatment group at each time point. Conclusion pHGF can reduce the damage degree of lung tissue by reducing inflammation， reducing oxidative damage and inhibiting apoptosis.

[Key words] Hepatocyte growth-promoting； Paraquat poisoning； Lung； Cell apoptosis； Apoptosis-related protein

百草枯（PQ）是一種常見的劇毒性觸殺型除草劑，在體內可以導致多個器官的損傷。肺是PQ中毒的主要靶器官[1]，常表現為早期的急性肺損傷及后期的肺纖維化[2]。PQ中毒機制復雜，細胞氧化損傷、炎癥/細胞因子失調及細胞凋亡均證明參與了PQ中毒過程[3-4]。促肝細胞生長素（pHGF）是一種多功能細胞因子，在細胞增殖、血管生成及抗細胞調亡、修復損傷組織等方面發揮著重要的生物學功能[5]。研究證明，pHGF通過阻止肺泡細胞的調亡、促進肺泡細胞的再生及肺血管的生成提高大鼠的運動耐量、氣體交換[6]。本研究通過PQ染毒大鼠建立肺損傷模型，探討pHGF對PQ中毒大鼠急性肺損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物

20%PQ水溶液，由先正達南通作物保護公司提供；pHGF注射液（規格：2 mL∶30 μg，批號：1505029），購自威海賽洛金藥業有限公司；Bax免疫組化試劑盒（批號：160708254ZC2）、Bcl-2免疫組化試劑盒（批號：160509660A）、免疫組化抗體稀釋液（批號：160615452f）、二抗試劑（批號：2017049）及DAB顯色劑試劑盒（批號：160509660A），購自上海邁新生物技術有限公司；腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（批號：8260243）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號：20160602），購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物

90只SPF級健康成年SD大鼠，雌雄各半，日齡50～60 d，體重（200±20）g，購于桂林醫學院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK桂2013-0001，批號：45000800000021，飼養條件：晝夜規律，溫度18～25℃，相對濕度50%～70%。

1.3 動物模型的建立及分組

將90只SD大鼠按照隨機數字表法分為三組：非藥物處理組，毒素處理組，治療組，各組30只。各組以第1、3、7天為觀察點。毒素處理組、治療組均以PQ（25 mg/kg）一次性腹腔注射染毒后，予治療組每天1次pHGF（50 μg/kg）腹腔注射，持續至第7天，非藥物處理組、毒素處理組注射等量生理鹽水作為對照。

1.4 取材及樣品制備

各組于第1、3、7天時間點取相同數目大鼠，以3 mL/kg的10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，以胸腹正中線為切口，暴露心臟于心尖搏動處進針采血，并分離肺臟取肺組織固定于10%中性福爾馬林溶液48 h后，常規石蠟包埋，備于HE染色及免疫組化檢測。

1.5 動脈血氧分壓（PaO2）檢測及方法

采取0.3 mL動脈血置于抗凝管內，半小時內送往桂林市第二人民醫院檢驗科，血氣分析儀檢測PaO2。

1.6 SOD、TNF-α測定及方法

將血漿于低溫下經離心半徑10 cm、3000 r/min離心20 min后，取上層清液血清，按照SOD、TNF-α試劑盒的步驟要求操作，分別應用水溶性四氮唑（WST-1）法、酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測SOD活力、TNF-α水平。

1.7 病理學檢查及方法

常規脫水、石蠟包埋，制作切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理組織學改變。

1.8 肺組織Bcl-2、Bax表達檢測及方法

將肺組織切片按照說明書操作，應用免疫組織化學（二步法）檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達。結果判斷：細胞漿或細胞膜有棕黃色顆粒沉著為陽性表達，計分標準：每張切片隨機選取5個高倍視野（10×40）觀察下，根據染色細胞的陽性數目及染色程度對Bcl-2、Bax陽性表達進行半定量分析[7-8]：不著色者為0分，著色淺黃為1分，著色棕黃為2分，著色棕褐為3分；著色范圍<5%計為0分，5%～<25%計為1分，25%～<50%計為2分，50%～ <75%計為3分，75%～100%計為4分；將每組各張切片的著色程度及著色范圍分數相加為計為最后分數。

1.9 統計學方法

應用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，利用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗，組間兩兩對比LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PaO2變化

與非藥物處理組比較，毒素處理組各時間點PaO2值均顯著降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；治療組第1、3天PaO2值較毒素處理組增高，差異有統計學意義（P < 0.05），其中第3天差異有高度統計學意義（P < 0.01），第7天PaO2值與毒素處理組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 血清SOD活力改變

與非藥物處理組比較，毒素處理組各時間點血清SOD水平均顯著降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；治療組與毒素處理組比較，各時間點血清SOD水平升高，差異有統計學意義（P < 0.05），其中第3天差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見表1。

2.3 血清TNF-α水平變化

與非藥物處理組比較，毒素處理組各時間點血清TNF-α水平均顯著升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）；與毒素處理組比較，治療組各時間點血清TNF-α水平均顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.01或P < 0.05）。見表1。

2.4 肺組織病理形態學改變

非藥物處理組肺泡結構清晰，壁清晰完整，肺泡腔內未見滲出，肺間質正常，未見炎癥細胞浸潤。毒素處理組肺泡結構破壞，部分肺泡腔內可見滲出，肺間質水腫，肺間隔顯著增寬，局部可見炎癥細胞浸潤，以第3天改變最明顯，第3天后，上述改變減輕。治療組表現為不同程度的肺泡炎改變，但肺泡結構破壞、肺間隔增寬及炎性細胞浸潤程度均較毒素處理組改善。見圖1。2.5 各組肺組織Bcl-2、Bax蛋白表達情況

非藥物處理組可見少量Bcl-2和Bax蛋白表達，主要分布在肺支氣管、肺泡上皮細胞及血管內皮細胞的胞漿內。與非藥物處理組比較，毒素處理組Bcl-2、Bax蛋白表達均明顯增強，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與毒素處理組比較，治療組Bcl-2蛋白在肺組織內表達明顯增強，差異有統計學意義（P < 0.01或P < 0.05），Bax蛋白表達減少，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表2及圖2～3（封三）。

3 討論

pHGF是一種肝源性的生物活性小分子物質，主要應用于肝功能損害的輔助治療[9]。pHGF可以促進HGF的表達，HGF是一種肺營養因子，具有促進肺血管內皮細胞分裂，誘導肺血管生成、肺泡上皮細胞生長，改善肺部炎癥及調節上皮細胞凋亡的作用[10-12]。

低氧血癥是衡量急性肺損傷程度及PQ中毒患者預后的重要因素[13]。本研究結果顯示，毒素處理組大鼠各時間點PaO2出現不同程度下降，其機制可能與PQ中毒后大鼠肺泡細胞功能降低，肺組織充血水腫，肺泡間隔增寬及部分肺泡壁塌陷導致通氣血流比失調有關；治療組較毒素處理組，大鼠PaO2在第1、3天有一定程度的改善，提示pHGF對早期PQ中毒大鼠的低氧血癥具有一定的改善功能，第7天PaO2改善不明顯（P > 0.05），可能與大鼠肺內炎性滲出液吸收、減少，肺纖維化啟動，肺功能暫時改善相關。

SOD是體內清除氧自由基（ROS）的重要酶之一，將ROS轉化為H2O2、O2，當PQ誘發肺組織細胞產生大量的ROS超出SOD清除能力，機體的氧化-抗氧化體系失衡，檢測SOD活性反映了機體清除ROS的能力，可作為PQ中毒患者的預測因子[14-15]。TNF-α是炎性反應的始動因子，可以增加炎癥細胞浸潤，分化并促進其他細胞因子、炎癥遞質的表達及分泌，形成錯綜復雜的細胞因子網絡，改變宿主的免疫應答能力[16]。研究證明，TNF-α與PQ中毒患者的預后存在相關性，對判斷患者病情嚴重程度及轉歸具有預測作用[17]。本研究結果顯示，毒素處理組SOD水平明顯降低，TNF-α水平明顯增高，提示細胞的氧化損傷、炎性反應參與了PQ中毒引起肺損傷過程。治療組各時間點SOD出現升高，TNF-α水平降低，提示pHGF能通過清除ROS發揮抗氧化作用，并對機體的炎性反應具有抑制作用。

細胞凋亡是PQ中毒所致急性肺損傷的一個非常重要的過程，PQ可以激活Bcl-2家族不同成員觸發細胞內細胞色素C釋放發生細胞凋亡，Bcl-2為抗凋亡調節蛋白，Bax為促凋亡蛋白，兩者形成一個凋亡調控系統[18-20]。本研究應用免疫組織化學技術檢測Bcl-2、Bax蛋白在肺組織中的表達，采用Remmele等[21]提出的兼顧陽性細胞百分比和染色強度的四級分級法進行半定量分析，結果顯示毒素處理組較非藥物處理組肺組織Bcl-2、Bax蛋白表達明顯增強，證明Bcl-2、Bax介導的細胞凋亡參與PQ中毒引起的肺損傷過程。予pHGF干預后，治療組肺組織Bcl-2蛋白表達增強，Bax蛋白表達減弱，提示pHGF抑制了肺組織內細胞的凋亡，主要通過上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達及減少促凋亡Bax蛋白表達發揮保護作用。

綜上所述，pHGF對PQ中毒大鼠急性肺損傷具有一定的保護作用，其機制可能與減輕細胞氧化損傷、抑制機體炎性反應及調節細胞凋亡相關。

[參考文獻]

[1] Yang H，Wen Y，Bin J，et al. Protection of bone marrow mesenchymal stem cells from acute lung injury induced by paraquat poisoning [J]. Clin Toxicol，2011，49（4）：298-302.

[2] 舒維，陳文龍，謝姝，等.硫化氫對百草枯中毒大鼠急性肺損傷及炎癥介質的影響[J].江西醫藥，2016，51（11）：1162-1164.

[3] Wang X，Luo F，Zhao H. Paraquat-induced reactive oxygen species inhibit neutrophil apoptosis via a p38 MAPK/NF-κB-IL-6/TNF-α positive-feedback circuit [J]. PLoS One，2014，9（4）：e93837.

[4] Dusinská M，Kovaciková Z，Vallová B，et al. Responses of alveolar macrophages and epithelial type Ⅱ cells to oxidative DNA damage caused by paraquat [J]. Carcinogenesis，1998，19（5）：809-812.

[5] 丁文捷，孫書珍.肝細胞生長因子及其受體與腎臟疾病[J].中國實用兒科雜志，2009，24（2）：145-147.

[6] Shigemura N，Sawa Y，Mizuno S，et al. Amelioration of pulmonary emphysema by in vivo gene transfection with hepatocyte growth factor in rats [J]. Circulation，2005，111（11）：1407-1414.

[7] 孟愛紅，陳芝蕓，嚴茂祥.銀杏葉提取物對肝纖維化大鼠肝細胞凋亡的影響[J].中華中醫藥學刊，2009，27（10）：2095-2097.

[8] 肖欣.VEGF與MMP-9在口腔扁平苔蘚和口腔鱗狀細胞癌中的表達及意義[D].吉林：吉林大學，2016.

[9] 王乾蘭.我國促肝細胞生長因子的研究和應用[J].中國生物工程雜志，2005，25（S1）：7-11.

[10] 周丹，呂福禎，陳英準.促肝細胞生長素對肺纖維化大鼠的干預作用及其途徑[J].中國臨床康復，2006，10（37）：74-77.

[11] Narasaraju T，Yang E，Samy RP，et al. Combination Therapy with Hepatocyte Growth Factor and Oseltamivir Confers Enhanced Protection Against Influenza Viral Pneumonia [J]. Curr Mol Med，2014，14（5）：690-702.

[12] 畢寧康，岳屹囡.促肝細胞生長素對腎缺血-再灌注大鼠肺損傷的影響[J].濟寧醫學院學報，2007，30（3）：185-188.

[13] Huang C，Zhang X. Prognostic significance of arterial blood gas analysis in the early evaluation of paraquat poisoning patients [J]. Clin Toxicol，2011，49（8）：734-738.

[14] 趙揚，謝繼，楊志洲，等.血清髓過氧化物酶、丙二醛和超氧化物歧化酶水平對百草枯中毒患者的預后價值研究[J].臨床急診雜志，2016，17（1）：22-25.

[15] 朱宏飛，馮丹，姚尚龍，等.大潮氣量機械通氣對大鼠肺組織急性炎癥、氧化應激及細胞凋亡的影響[J].華中科技大學學報：醫學版，2010，39（1）：59-63.

[16] 唐文姣.百草枯中毒患者血清細胞因子與抗氧化能力相關性分析[J].中國現代醫生，2013，51（27）：25-26.

[17] 龔媛，張浩，李曉莉，等.急性百草枯中毒早期患者細胞因子與動脈血氣分析[J].中國工業醫學雜志，2014，27（4）：279-280.

[18] Cai Q，Lu Z，Hong G，et al. Recombinant adenovirus Ad-RUNrf2 reduces paraquat-induced A549 injury [J]. Hum Exp Toxicol，2012，31（11）：1102-1112.

[19] 高艷敏，趙雄，丁佳，等.百草枯中毒大鼠的肝損傷及抗氧化藥物對其保護作用[J].肝臟，2009，14（3）：210-213.

[20] Kastelan M，Massari LP，Brajac I. The role of Bcl-2 family proteins in psoriasis [J]. Lijecnicki Vjesnik，2010， 132（1/2）：31-33.

[21] Remmele W，Stegner HE. Recommendation for uniform definition of an immunoreactive score（IRS）for immuno？鄄histochemical estrogen receptor detection（ER-ICA）in breast cancer tissue [J]. Der Pathologe，1987，8（3）：138-140.

（收稿日期：2017-01-06 本文編輯：張瑜杰）