特雷唑來對結(jié)核分枝桿菌體外抑菌作用的初步研究

廖傳玉 李同心 陳天剛 羅明 張匯征 鄧仁麑 易學(xué)軍 周剛 王靜

特雷唑來對結(jié)核分枝桿菌體外抑菌作用的初步研究

廖傳玉 李同心 陳天剛 羅明 張匯征 鄧仁麑 易學(xué)軍 周剛 王靜

目的 評價特雷唑來對不同耐藥類型的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的體外抑菌作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 采用微孔板觀察法，測定特雷唑來對標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv及臨床分離的敏感、單耐藥、多耐藥、耐多藥以及廣泛耐藥各20株(共100株)的 MIC，再測定特雷唑來與7種常用抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用時，對 H37Rv和 10株 MTB臨床分離株(敏感、單耐藥、多耐藥、耐多藥以及廣泛耐藥各2株)的 MIC，通過計(jì)算分級抑菌濃度指數(shù)(FICI)，觀察特雷唑來對結(jié)核分枝桿菌的體外抑菌作用以及與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用時是否有協(xié)同作用。結(jié)果 94.0% (94/100)的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株可被≤0.5mg/L的特雷唑來抑制生長，特雷唑來對敏感株、 MDR菌株(耐多藥和廣泛耐藥)及非MDR耐藥菌株(單耐藥和多耐藥)的MIC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.578，P>0．05)。特雷唑來與7種抗結(jié)核藥物在體外聯(lián)合使用時對結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv和臨床分離株均未表現(xiàn)出相關(guān)性。 結(jié)論 特雷唑來對結(jié)核分枝桿菌,尤其是耐多藥和廣泛耐藥菌株，均有很好的體外抑菌作用，且與細(xì)菌對其他抗結(jié)核藥物是否耐藥無關(guān)。

特雷唑來；結(jié)核分枝桿菌；體外抑菌作用

結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人民身體健康的慢性傳染性疾病。世界衛(wèi)生組織(WHO)新出版的《2015年全球結(jié)核病報告》[1]以及《全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查資料匯編》[2]，均強(qiáng)調(diào)全球和我國新發(fā)肺結(jié)核患者以及新發(fā)耐多藥結(jié)核病患者逐年增加。耐藥結(jié)核病尤其耐多藥(MDR-TB)和廣泛耐藥(XDR-TB)結(jié)核病已成為全球結(jié)核控制工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。研究耐多藥結(jié)核(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核(XDR-TB)耐藥機(jī)制以尋找新的抗耐多藥結(jié)核(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核(XDR-TB)藥物變得刻不容緩。第一代噁唑烷酮類藥物利奈唑胺在我國結(jié)核病臨床治療中剛剛起步[3]，第二代噁唑烷酮類藥物特雷唑來(torezolid)對臨床所有的G+,某些G-菌及非典型衣原體顯示出較好的抑菌作用[4]。本研究通過測定第二代噁唑烷酮類藥物特雷唑來對臨床分離的結(jié)核分枝桿菌的體外抑菌作用，探討特雷唑來與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用時的體外相互作用，為臨床合理使用特雷唑來提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

資料與方法

一、材料

1 菌株來源：結(jié)核分枝桿菌菌株：H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC27294)和100株臨床分離株均為重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心結(jié)核實(shí)驗(yàn)室(2015.01.01-2016.05.30)保留菌株。100株臨床分離株已經(jīng)結(jié)核菌藥物敏感性試驗(yàn)(比例法)[5]確定的敏感、單耐藥、多耐藥、耐多藥和廣泛耐藥的結(jié)核分枝桿菌菌株各20株。

2 主要藥物和試劑：特雷唑來(美國MCE上海皓鴻藥物研究有限公司原粉),異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、卡那霉素、氧氟沙星、利福布汀均為美國Sigma公司產(chǎn)品。

二、方法

1 微孔板觀察法檢測MIC (mg/L)：特雷唑來0.016-8,異煙肼0.0125-1.6，利福平0.0625-8，鏈霉素0.125-16，乙胺丁醇0.3125-40，卡那霉素0.3125-40，氧氟沙星0.125-16，利福布汀0.03125-4，藥物濃度以二倍稀釋方式由高至低遞減[3]。將標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和100株臨床分離菌株轉(zhuǎn)種于改良羅氏培養(yǎng)基上，刮取培養(yǎng)2-3周的新鮮菌落，磨菌比濁制成1麥?zhǔn)蠁挝弧Ｔ儆靡后w培養(yǎng)基稀釋100倍后，向無菌 96孔板各微孔加入 200 μL菌液[6]。各菌株均設(shè)2個不含抗菌藥物對照孔，2個含10%及1%菌液濃度的生長對照孔和2個僅含有液體培養(yǎng)基的空白對照孔。將96孔板于37 ℃孵育，7 d后每日觀察結(jié)果，孔底出現(xiàn)肉眼可見的白色菌體沉淀為生長陽性，無肉眼可見的菌體沉淀為生長陰性。本研究中MIC定義為孔底可見白色菌體沉淀<10%對照孔的最低藥物濃度。空白對照孔出現(xiàn)白色沉淀時，提示檢測板有污染，需重新進(jìn)行檢測[7]。

2 觀察特雷唑來與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用的體外相互作用：從上述菌株中選取 H37Rv和10株臨床分離株，其中包括敏感株、單耐藥菌株、多耐藥菌株、耐多藥菌株、廣泛耐藥菌株各2株，進(jìn)行藥物相互作用實(shí)驗(yàn)。菌株對上述 7種藥物單獨(dú)應(yīng)用的MIC檢測及其與特雷唑來聯(lián)合應(yīng)用的 MIC檢測方法同上。聯(lián)合用藥中每種抗結(jié)核藥的濃度范圍以二倍遞增的方式，選取 1/32-8倍 MIC的 9個濃度[8]。計(jì)算分級抑菌濃度指數(shù) (fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)：FICI=甲藥聯(lián)用 MIC/甲藥單用 MIC+乙藥聯(lián)用 MIC/乙藥單用 MIC，F(xiàn)ICI≤0．5為協(xié)同作用，0．54為拮抗作用[8]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3組間 MIC比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、特雷唑來對體外不同耐藥類型結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的抑菌作用

100株 MTB臨床分離株94株(94.0%)可被≤0.5mg/L特雷唑來抑制生長，其余 6株(敏感菌株1株、非MDR耐藥菌株2株和 MDR耐藥菌株3株)的 MIC>0.5mg/L。特雷唑來對敏感菌株、非MDR耐藥菌株和 MDR 耐藥菌株的 MIC 主要集中于 0．125 mg/L，在 3組中的比例分別為 65.00%(13/20)、60.00%(24/40)和 55.00% (22/40)。3組的特雷唑來MIC 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=0.578，P>0.05)。(見表1)。

表1 不同耐藥類型菌株對特雷唑來的最低抑菌濃度分布(株)

χ2=0．578，P>0.05

二、特雷唑來與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用的體外抑菌作用

特雷唑來與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用對 H37Rv和10株MTB臨床分離株的體外抑制作用(見表2、3)。對于H37Rv,特雷唑來與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用后，均表現(xiàn)為無關(guān)。特雷唑來與異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、卡那霉素和氧氟沙星聯(lián)合用藥，對10株臨床株均表現(xiàn)為無關(guān)；特雷唑來與利福布汀聯(lián)合用藥時，其中1株為協(xié)同(FICI=0.5)，另1株為拮抗(FICI=4.5)，其余8株FICI均未表現(xiàn)出相關(guān)性。

表2 特雷唑來與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用對H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的作用(mg/L)

表3 特雷唑來與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用對10株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的作用

討 論

利奈唑胺作為第一代噁唑烷酮類藥物，已顯示出對結(jié)核病有良好的治療效果[3]。噁唑烷酮類藥物，可抑制蛋白質(zhì)合成的起始階段[9]，與其他抗菌藥具有不同的作用機(jī)制[10]，不會與其他抗菌藥發(fā)生交叉和耐藥現(xiàn)象。黃海榮的研究表明，利奈唑胺有很好的抗MTB活性，且與常用抗結(jié)核藥物在作用機(jī)制上完全沒有交叉[3]。微孔板觀察法檢測藥物對細(xì)菌的 MIC值，已廣泛用于抗結(jié)核藥物的高通量篩選。我們采用微孔板觀察法測定第二代噁唑烷酮類藥物特雷唑來對 100株 MTB的 MIC值，結(jié)果顯示，94.0% (94/100)的MTB菌株可被≤0.5mg/L特雷唑來抑制。抗MTB菌活性略優(yōu)于黃海榮[3]報道利奈唑胺MIC≤1.0 mg/L(94.2%)。與對MRSA和MSSA的MIC均為0.5 μg/mL一致[9]。所以，本研究結(jié)果提示，特雷唑來對 MTB敏感株和耐藥株均有良好的抑菌作用，且敏感株，MDR菌株,及其他非MDR耐藥菌株 MIC 之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)核病的化療原則是聯(lián)合用藥，其目的是利用多種抗結(jié)核藥物的交叉殺菌作用，提高其殺菌和抑菌能力，以保證療效和防止耐藥性的產(chǎn)生[11]。研究中對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行雙向梯度的 MIC測定，根據(jù) 2種單藥 MIC 設(shè)定 9個濃度采用棋盤微量稀釋法[12]，通過計(jì)算 FICI的方法，準(zhǔn)確評價特雷唑來與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用的體外相互作用。結(jié)果表明特雷唑來與7種常用抗結(jié)核藥物聯(lián)用時，對 H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株均表現(xiàn)出無相關(guān)性。特雷唑來與 7種常用抗結(jié)核藥物聯(lián)用時，對 10株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的聯(lián)合作用，其中1株與利福布汀聯(lián)用時為協(xié)同( FICI=0.5)，另1株為拮抗(FICI=4.5)，但由于兩株FICI處于臨界值，提示拮抗和協(xié)同作用較輕微，其余8株均表現(xiàn)為無關(guān)。另外，其中相同的2種藥物對不同菌株聯(lián)合用藥時效果不一致，可能與其濃度相關(guān)[3]。研究結(jié)果顯示，特雷唑來與抗結(jié)核藥物的聯(lián)用對MTB臨床分離株和標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv均表現(xiàn)出不相關(guān)。

王呂鳴[13]報道，噁唑烷酮類抗菌藥中最有發(fā)展前景的是torezolid磷酸鹽，Torezolid作為磷酸脂型前藥，大大提高了單胺氧化酶抑制劑的抑制作用，這是較于利奈唑胺的優(yōu)點(diǎn)，該藥在PH>5的水溶液中的溶解度為130mg·mL-1,口服生物利用度達(dá)到了91.7%。因torezolid解決了水溶性問題，使其可以口服或靜脈注射，又因其極大改善了生物利用度，所以torezolid磷酸鹽在臨床有很好的前景。

本研究存在以下不足：① 微孔板觀察法測定特雷唑來對分枝桿菌 MIC 的可靠性尚無定論，測定異煙肼和利福平的 MIC較為可靠，但測定乙胺丁醇和鏈霉素的重復(fù)性較差[14-15]；② 本次研究是特雷唑來對MTB的體外抑菌作用的初步研究，沒有進(jìn)行臨床用藥觀察，至于特雷唑來的抗結(jié)核作用，在今后的工作中，我們尚需多中心的深入研究以進(jìn)一步證實(shí)。

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Preliminary study of torezolid on in vitro bacteriostasis of Mycobacterium tuberculosis

LIAOChuan-yu,LITong-xin,CHENTian-gang,LUOMing,ZHANGHui-zheng,DENRen-ni,YIXue-jun,ZHOUGang,WANGJing
DepartmentofClinicalLaboratory,ChongqingInfectiousDiseaseMedicalCenter,Chongqing400036,China

Objective To study torezolid on in vitro bacteriostasis of different types of Mycobacterium tuberculosis. Methods The minimal inhibitory concentrations (MICs) of torezolid against sensitive, single-drug resistant (SDR), poly-drug resistant (PDR), multi-drug resistant (MDR), and extensive-drug resistant (XDR) Mycobacterium tuberculosis strains isolated clinically were determined by microplate assay. The interactions between torezolid and isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol, kanamycin, ofloxacin and rifabutin were also tested in vitro by fractional inhibitory concentration index (FICI) method. Results 94.0% (94/100) of the Mycobacterium tuberculosis isolates were inhibited by torezolid at concentration ≤0.5 mg/L. There was no statistical difference in the MIC value of sensitive strains, MDR strains and non-MDR strains (χ2=0.578,P>0.05). There was no significant correlation between clinically standard isolates H37Rv and other clinical isolates treated with torezolid and 7 other anti-TB drugs. Conclusion Torezolid shows good in vitro activity against Mycobacterium tuberculosis clinical isolates, especially for MDR and XDR strains, regardless of the drug resistant parameters.

torezolid; Mycobacterium tuberculosis; in vitro antibacterial activities

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.07.002

重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研計(jì)劃項(xiàng)目(No 2013-2-141)

400036 重慶，重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心檢驗(yàn)科

王靜，E-mail:403413860@qq.com

2016-11-23]