S100A4、VEGF在非小細胞肺癌中的表達及其相關性的研究

曹睿杰 張玲 周敏 官兵 鐘杉 洪玉萍

S100A4、VEGF在非小細胞肺癌中的表達及其相關性的研究

曹睿杰1張玲3周敏1官兵2鐘杉1洪玉萍2

目的 探討S100A4、VEGF在非小細胞肺癌中的表達，分析與臨床因素的關系，探討其臨床意義及兩者的相關性。方法 收集非小細胞肺癌病例，免疫組化檢測非小細胞肺癌及其轉移淋巴結組織中S100A4和VEGF的表達，通過圖像分析進行定量分析；分析S100A4和VEGF的表達與臨床病理的關系，研究S100A4在非小細胞肺癌血管生成中與VEGF表達的相關性。結果 肺鱗癌、腺癌標本及其相關的轉移淋巴結中S100A4、VEGF的表達的強度顯著高于癌旁組織(P<0.05)。S100A4、VEGF在肺鱗癌、腺癌的表達中均與TNM分期有關(P<0.05)；與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度無關(P>0.05)。VEGF與S100A4在非小細胞肺癌的表達中呈正相關(P<0.05)。結論 S100A4、VEGF參與了非小細胞肺癌的發生、發展和轉移，兩者在腫瘤血管生成中有協同作用。

S100A4；VEGF；非小細胞肺癌；免疫組化

隨著環境及生活方式的改變，肺癌的發病和死亡率逐年升高，已位居所有癌癥發病率和死亡率之首[1]。其中超過80%的肺癌是非小細胞肺癌。到目前為止肺癌的發病機制尚不明確。隨著人類基因密碼的探索，對基因的研究也逐漸深入，學者們發現在腫瘤的發生、發展及轉移過程的各階段都有基因的參與。如P53、EGFR、VEGF等對腫瘤的發生、發展的影響已經逐漸被發現，基因研究及肺癌的靶向治療也是當前非小細胞肺癌治療的熱點。S100A4蛋白在非小細胞肺癌中的高表達也已經被人們發現，有研究顯示S100A4蛋白與非小細胞肺癌的發病及轉移有關[2]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前被認為是作用最強、特異性最高的血管生成調控因子,在非小細胞肺癌的新生血管的形成中起關鍵作用,并與腫瘤的浸潤、轉移有關[3]。本研究通過收集我院近年來胸外科手術并經病理證實的非小細胞肺癌組織蠟塊標本，采用免疫組化法檢測非小細胞肺癌組織及其轉移淋巴結組織中S100A4和VEGF的表達，通過圖像分析進行定量分析；進一步分析二者在病理分類、分級、TNM分期中的差異性，分析S100A4 和VEGF的表達與臨床病理的關系，研究S100A4在非小細胞肺癌腫瘤血管生成中的作用與VEGF表達的相關性，探討S100A4是否與VEGF在非小細胞肺癌的過程中發揮協同作用。

資料與方法

一、一般資料

收集2010年1月至2014年12月上海六院金山分院手術切除并病理證實為NSCLC伴有淋巴結轉移的病例60例。60例患者中鱗癌28例(A組)，腺癌32例(B組)(見表1)。

表1 一般資料

二、試劑

一抗：兔抗人S100A4、VEGF單克隆抗體，二抗：標記長臂生物素的山羊抗兔IgG(以上試劑均采購于武漢博士德生物有限公司)。

三、方法

1 病理切片的制備及免疫組織化學染色：由病理科醫生制作切片，根據試劑附帶的流程操作，一抗為S100A4、VEGF抗體，二抗為生物素化山羊抗兔IgG。

2 免疫組化判斷與圖像分析：以細胞漿出現棕黃色顆粒者為陽性。圖像分析：置切片于顯微鏡下，隨機選取完整而不重疊的視野進行觀察并拍攝照片，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析每個視野的S100A4、VEGF積累光密度值(IOD值)等。以切片的IOD均值作為表達強度的參考值，以大于癌旁組織x(—)±2s為陽性判斷標準。

結 果

一、免疫組化結果

1 S100A4免疫組化下可見鱗癌細胞的胞漿中有少量淡黃色的染色顆粒；腺癌癌細胞的胞漿中可見棕黃色的染色顆粒(見圖1)。Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像后提示，肺鱗癌、腺癌標本及其相關的轉移淋巴結中S100A4表達的強度顯著高于癌旁組織(P<0.05)(見表2)。

2 VEGF免疫組化下鱗癌細胞胞漿有淡黃色著色，腺癌癌細胞胞漿著色明顯(見圖2)。Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像后提示，肺鱗癌、腺癌標本及其相關的轉移淋巴結中VEGF表達的強度顯著高于癌旁組織(P<0.05)(P<0.05)(見表3)。

圖1-1鱗癌 S100A4 圖1-2腺癌 S100A4 圖1-3 鱗癌淋巴結S100A4 圖1-4 腺癌淋巴結S100A4 圖2-1 鱗癌VEGF 圖2-2 腺癌VEGF 圖2-3 鱗癌淋巴結VEGF 圖2-4 腺癌淋巴結VEGF

表2 S100A4的表達結果分析

表3 VEGF表達結果分析

二、與NSCLC的臨床因素的相關性

S100A4、VEGF在肺鱗癌、腺癌的表達中均與TNM分期有關(P<0.05)；與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小無關(P>0.05)(見表4、5)。

三、S100A4、VEGF在非小細胞肺癌表達的相關性

表4 S100A4、VEGF與鱗癌臨床特征的關系

表5 S100A4、VEGF與腺癌臨床特征的關系

表6 S100A4與VEGF表達的相關性(Pearson系數)

討 論

肺癌的發病機制復雜，許多環節仍模糊不清，但血管生成在肺癌的發生和轉移中的重要性已經得到學者的共識。相關動物實驗通過抑制肺癌血管生成可明顯抑制腫瘤的發展，目前也已有上市的抑制肺癌血管生成的相關基因藥物如吉非替尼、厄洛替尼、克唑替尼等在晚期NSCLC部分人群展示了不錯的治療效果，成功改善病人的生活質量，但適合人群仍極為有限。肺癌血管生成的具體過程尚未明確揭示，參與的基因也未徹底揭秘，為了更多的肺癌病人能得到有效的基因靶向治療，需要更多的研究及試驗來引導新型基因藥物的研發。

VEGF是目前已知的作用最強的促血管生成因子之一。多項研究證實在NSCLC組織中VEGF的高表達及其在血管生成中的作用[4]。VEGF可直接并特異與血管內皮細胞上VEGF受體結合并可以產生增加微血管通透性、促進基底膜降解和調節促血管生成相關的基因的表達等效應[5]；抑制VEGF在腫瘤中的表達可明顯抑制肺癌血管形成、減少腫瘤體積及提高裸鼠的生存時間[6]。此次試驗通過免疫組化發現在NSCLC及其相應的轉移淋巴結中均有著顯著的VEGF表達的上調，考慮VEGF的促血管形成作用在NSCLC的發生、發展及轉移中發揮著重要的作用，與上述研究的結論也是相符合的。

S100蛋白家族也是一個與腫瘤密切相關的蛋白質家族, 只在脊椎動物中表達，其家族中有多個成員與腫瘤的發病有關。S100A4蛋白在許多正常人體組織細胞中也有表達，但在NSCLC[2]等腫瘤細胞卻發現了S100A4明顯的高表達。S100A4蛋白與NSCLC的關系也逐漸引起學者的重視。有研究證實S100A4過度表達時能促進腫瘤轉移的進程[7]。通過對鱗狀細胞癌病理切片進行免疫組化分析發現S100A4蛋白的高表達與患者術后病理的分期、淋巴結轉移有關[8]。日本學者[9]研究發現S100A4在各種不同病理類型的肺癌中都有S100A4的過度表達，而通過抑制NSCLC細胞中S100A4的表達后可明顯降低腫瘤細胞的增殖速度及侵襲能力，考慮S100A4蛋白可通過調節腫瘤細胞增殖來促進肺癌發展。與本次研究結果是相符合的。

腫瘤的生長關鍵在于腫瘤細胞的增殖及血管的生成，目前對于VEGF的研究較多，VEGF在各系統腫瘤中的作用也被學者們逐漸發現，在NSCLC中VEGF表達的上調及血管生成作用已經達到共識，本次研究通過免疫組化發現VEGF在肺鱗癌、腺癌的表達中均與TNM分期有關(P<0.05)；與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小無關(P>0.05)。證實了VEGF通過血管生成參與NSCLC的發生及轉移。S100A4在肺癌中的高表達及其對NSCLC轉移中的作用也引起學者的興趣，有研究證實了S100A4在NSCLC表達的上調及在TNM分期、淋巴結轉移的差異是有意義的，推測S100A4在NSCLC的發生及轉移中發揮作用。推測 S100A4蛋白作為一個促血管發生因子，可通過增強內皮細胞的移動性、減少血管生成抑制因子的產生而促進血管的生成，促進腫瘤的生長和遠處轉移[10]。本實驗通過圖像分析軟件檢測結果提示S100A4與VEGF在NSCLC中均有著顯著的高表達，且其高表達呈正相關，兩者均有促血管生成作用，故推測兩者在腫瘤血管生成中有協調作用。

已有研究證實VEGF及S100A4在胰腺癌中的血管生成作用，但S100A4與VEGF在NSCLC中的表達的相關性的研究尚未見報道，本次研究發現在NSCLC中VEGF及S100A4均有著顯著的高表達，且兩者的表達呈正相關，故推測S100A4與VEGF在NSCLC的腫瘤血管生成有發揮協同作用，同時沉默VEGF及S100A4可能會更有效的抑制腫瘤血管的生成，可能是成為肺癌治療的新策略。

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Correlation analysis of the expression of S100A4 and VEGF in non-small cell lung cancer tissues

CAORui-jie,ZHANGLing,ZHOUMin,GUANBing,ZHONGShan,HONGYu-ping
DepartmentofRespiratoryMedicine,JinshanBranchoftheSixthPeople’sHospitalofShanghai,Shanghai201500,China

Objective To investigate the expression of S100A4 and VEGF in non-small cell lung cancer tissues, and to analyze the correlation with clinical factors. Methods NSCLC cases were collected and the expression of S100A4 and VEGF in NSCLC and metastasis lymphnode tissues were detected by immunohistochemical method respectively, and the difference were done by Image-Pro Plus 6.0 image analysis software. The relationship of S100A4 and VEGF with clinical factors were further analyzed, and the correlation between the tumor angiogenesis of them in NSCLC was analyzed. Results The expression of S100A4 and VEGF proteins in lung squamous cell carcinomas, adenocarcinomas and metastasis lymphnode tissues were significantly higher than in adjacent no-malignant tissues (P<0.05). The expression of S100A4 and VEGF were significantly correlated with TNM stages (P<0.05), and not related with gender, age, tumor size and pathological grade (P>0.05). The expression of VEGF in NSCLC had significant relationship with S100A4 (P<0.05). Conclusion S100A4 and VEGF may play a role in the carcinogenesis, development and metastasis of the non-small cell lung cancer. Both of them have synergistic effect on tumor formation.

S100A4 protein; vascular endothelial growth factor; non-small cell lung cancer; immunohistochemical

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.07.010

上海市金山區衛計委青年科研項目(No JSKJ-KTQN-2014-16)

201500 上海，上海市第六人民醫院金山分院1.呼吸科，2.病理科 3. 201501 上海,上海市金山區眾人老年護理醫院內科

周敏，E-mail:zhoumin-1209@163.com

2017-02-27]