S100A4、VEGF在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其相關(guān)性的研究

曹睿杰 張玲 周敏 官兵 鐘杉 洪玉萍

S100A4、VEGF在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其相關(guān)性的研究

曹睿杰1張玲3周敏1官兵2鐘杉1洪玉萍2

目的 探討S100A4、VEGF在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)，分析與臨床因素的關(guān)系，探討其臨床意義及兩者的相關(guān)性。方法 收集非小細(xì)胞肺癌病例，免疫組化檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌及其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中S100A4和VEGF的表達(dá)，通過(guò)圖像分析進(jìn)行定量分析；分析S100A4和VEGF的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系，研究S100A4在非小細(xì)胞肺癌血管生成中與VEGF表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 肺鱗癌、腺癌標(biāo)本及其相關(guān)的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中S100A4、VEGF的表達(dá)的強(qiáng)度顯著高于癌旁組織(P<0.05)。S100A4、VEGF在肺鱗癌、腺癌的表達(dá)中均與TNM分期有關(guān)(P<0.05)；與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)。VEGF與S100A4在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)中呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 S100A4、VEGF參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，兩者在腫瘤血管生成中有協(xié)同作用。

S100A4；VEGF；非小細(xì)胞肺癌；免疫組化

隨著環(huán)境及生活方式的改變，肺癌的發(fā)病和死亡率逐年升高，已位居所有癌癥發(fā)病率和死亡率之首[1]。其中超過(guò)80%的肺癌是非小細(xì)胞肺癌。到目前為止肺癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確。隨著人類基因密碼的探索，對(duì)基因的研究也逐漸深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程的各階段都有基因的參與。如P53、EGFR、VEGF等對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的影響已經(jīng)逐漸被發(fā)現(xiàn)，基因研究及肺癌的靶向治療也是當(dāng)前非小細(xì)胞肺癌治療的熱點(diǎn)。S100A4蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的高表達(dá)也已經(jīng)被人們發(fā)現(xiàn)，有研究顯示S100A4蛋白與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病及轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前被認(rèn)為是作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生成調(diào)控因子,在非小細(xì)胞肺癌的新生血管的形成中起關(guān)鍵作用,并與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]。本研究通過(guò)收集我院近年來(lái)胸外科手術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)的非小細(xì)胞肺癌組織蠟塊標(biāo)本，采用免疫組化法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織及其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中S100A4和VEGF的表達(dá)，通過(guò)圖像分析進(jìn)行定量分析；進(jìn)一步分析二者在病理分類、分級(jí)、TNM分期中的差異性，分析S100A4 和VEGF的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系，研究S100A4在非小細(xì)胞肺癌腫瘤血管生成中的作用與VEGF表達(dá)的相關(guān)性，探討S100A4是否與VEGF在非小細(xì)胞肺癌的過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同作用。

資料與方法

一、一般資料

收集2010年1月至2014年12月上海六院金山分院手術(shù)切除并病理證實(shí)為NSCLC伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例60例。60例患者中鱗癌28例(A組)，腺癌32例(B組)(見(jiàn)表1)。

表1 一般資料

二、試劑

一抗：兔抗人S100A4、VEGF單克隆抗體，二抗：標(biāo)記長(zhǎng)臂生物素的山羊抗兔IgG(以上試劑均采購(gòu)于武漢博士德生物有限公司)。

三、方法

1 病理切片的制備及免疫組織化學(xué)染色：由病理科醫(yī)生制作切片，根據(jù)試劑附帶的流程操作，一抗為S100A4、VEGF抗體，二抗為生物素化山羊抗兔IgG。

2 免疫組化判斷與圖像分析：以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。圖像分析：置切片于顯微鏡下，隨機(jī)選取完整而不重疊的視野進(jìn)行觀察并拍攝照片，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析每個(gè)視野的S100A4、VEGF積累光密度值(IOD值)等。以切片的IOD均值作為表達(dá)強(qiáng)度的參考值，以大于癌旁組織x(—)±2s為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié) 果

一、免疫組化結(jié)果

1 S100A4免疫組化下可見(jiàn)鱗癌細(xì)胞的胞漿中有少量淡黃色的染色顆粒；腺癌癌細(xì)胞的胞漿中可見(jiàn)棕黃色的染色顆粒(見(jiàn)圖1)。Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像后提示，肺鱗癌、腺癌標(biāo)本及其相關(guān)的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中S100A4表達(dá)的強(qiáng)度顯著高于癌旁組織(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

2 VEGF免疫組化下鱗癌細(xì)胞胞漿有淡黃色著色，腺癌癌細(xì)胞胞漿著色明顯(見(jiàn)圖2)。Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像后提示，肺鱗癌、腺癌標(biāo)本及其相關(guān)的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中VEGF表達(dá)的強(qiáng)度顯著高于癌旁組織(P<0.05)(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

圖1-1鱗癌 S100A4 圖1-2腺癌 S100A4 圖1-3 鱗癌淋巴結(jié)S100A4 圖1-4 腺癌淋巴結(jié)S100A4 圖2-1 鱗癌VEGF 圖2-2 腺癌VEGF 圖2-3 鱗癌淋巴結(jié)VEGF 圖2-4 腺癌淋巴結(jié)VEGF

表2 S100A4的表達(dá)結(jié)果分析

表3 VEGF表達(dá)結(jié)果分析

二、與NSCLC的臨床因素的相關(guān)性

S100A4、VEGF在肺鱗癌、腺癌的表達(dá)中均與TNM分期有關(guān)(P<0.05)；與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)(見(jiàn)表4、5)。

三、S100A4、VEGF在非小細(xì)胞肺癌表達(dá)的相關(guān)性

表4 S100A4、VEGF與鱗癌臨床特征的關(guān)系

表5 S100A4、VEGF與腺癌臨床特征的關(guān)系

表6 S100A4與VEGF表達(dá)的相關(guān)性(Pearson系數(shù))

討 論

肺癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，許多環(huán)節(jié)仍模糊不清，但血管生成在肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的重要性已經(jīng)得到學(xué)者的共識(shí)。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)抑制肺癌血管生成可明顯抑制腫瘤的發(fā)展，目前也已有上市的抑制肺癌血管生成的相關(guān)基因藥物如吉非替尼、厄洛替尼、克唑替尼等在晚期NSCLC部分人群展示了不錯(cuò)的治療效果，成功改善病人的生活質(zhì)量，但適合人群仍極為有限。肺癌血管生成的具體過(guò)程尚未明確揭示，參與的基因也未徹底揭秘，為了更多的肺癌病人能得到有效的基因靶向治療，需要更多的研究及試驗(yàn)來(lái)引導(dǎo)新型基因藥物的研發(fā)。

VEGF是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子之一。多項(xiàng)研究證實(shí)在NSCLC組織中VEGF的高表達(dá)及其在血管生成中的作用[4]。VEGF可直接并特異與血管內(nèi)皮細(xì)胞上VEGF受體結(jié)合并可以產(chǎn)生增加微血管通透性、促進(jìn)基底膜降解和調(diào)節(jié)促血管生成相關(guān)的基因的表達(dá)等效應(yīng)[5]；抑制VEGF在腫瘤中的表達(dá)可明顯抑制肺癌血管形成、減少腫瘤體積及提高裸鼠的生存時(shí)間[6]。此次試驗(yàn)通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)在NSCLC及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中均有著顯著的VEGF表達(dá)的上調(diào)，考慮VEGF的促血管形成作用在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，與上述研究的結(jié)論也是相符合的。

S100蛋白家族也是一個(gè)與腫瘤密切相關(guān)的蛋白質(zhì)家族, 只在脊椎動(dòng)物中表達(dá)，其家族中有多個(gè)成員與腫瘤的發(fā)病有關(guān)。S100A4蛋白在許多正常人體組織細(xì)胞中也有表達(dá)，但在NSCLC[2]等腫瘤細(xì)胞卻發(fā)現(xiàn)了S100A4明顯的高表達(dá)。S100A4蛋白與NSCLC的關(guān)系也逐漸引起學(xué)者的重視。有研究證實(shí)S100A4過(guò)度表達(dá)時(shí)能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的進(jìn)程[7]。通過(guò)對(duì)鱗狀細(xì)胞癌病理切片進(jìn)行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)S100A4蛋白的高表達(dá)與患者術(shù)后病理的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。日本學(xué)者[9]研究發(fā)現(xiàn)S100A4在各種不同病理類型的肺癌中都有S100A4的過(guò)度表達(dá)，而通過(guò)抑制NSCLC細(xì)胞中S100A4的表達(dá)后可明顯降低腫瘤細(xì)胞的增殖速度及侵襲能力，考慮S100A4蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖來(lái)促進(jìn)肺癌發(fā)展。與本次研究結(jié)果是相符合的。

腫瘤的生長(zhǎng)關(guān)鍵在于腫瘤細(xì)胞的增殖及血管的生成，目前對(duì)于VEGF的研究較多，VEGF在各系統(tǒng)腫瘤中的作用也被學(xué)者們逐漸發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中VEGF表達(dá)的上調(diào)及血管生成作用已經(jīng)達(dá)到共識(shí)，本次研究通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)VEGF在肺鱗癌、腺癌的表達(dá)中均與TNM分期有關(guān)(P<0.05)；與年齡、性別、分化程度、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)。證實(shí)了VEGF通過(guò)血管生成參與NSCLC的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。S100A4在肺癌中的高表達(dá)及其對(duì)NSCLC轉(zhuǎn)移中的作用也引起學(xué)者的興趣，有研究證實(shí)了S100A4在NSCLC表達(dá)的上調(diào)及在TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異是有意義的，推測(cè)S100A4在NSCLC的發(fā)生及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。推測(cè) S100A4蛋白作為一個(gè)促血管發(fā)生因子，可通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的移動(dòng)性、減少血管生成抑制因子的產(chǎn)生而促進(jìn)血管的生成，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)圖像分析軟件檢測(cè)結(jié)果提示S100A4與VEGF在NSCLC中均有著顯著的高表達(dá)，且其高表達(dá)呈正相關(guān)，兩者均有促血管生成作用，故推測(cè)兩者在腫瘤血管生成中有協(xié)調(diào)作用。

已有研究證實(shí)VEGF及S100A4在胰腺癌中的血管生成作用，但S100A4與VEGF在NSCLC中的表達(dá)的相關(guān)性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本次研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC中VEGF及S100A4均有著顯著的高表達(dá)，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)，故推測(cè)S100A4與VEGF在NSCLC的腫瘤血管生成有發(fā)揮協(xié)同作用，同時(shí)沉默VEGF及S100A4可能會(huì)更有效的抑制腫瘤血管的生成，可能是成為肺癌治療的新策略。

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Correlation analysis of the expression of S100A4 and VEGF in non-small cell lung cancer tissues

CAORui-jie,ZHANGLing,ZHOUMin,GUANBing,ZHONGShan,HONGYu-ping
DepartmentofRespiratoryMedicine,JinshanBranchoftheSixthPeople’sHospitalofShanghai,Shanghai201500,China

Objective To investigate the expression of S100A4 and VEGF in non-small cell lung cancer tissues, and to analyze the correlation with clinical factors. Methods NSCLC cases were collected and the expression of S100A4 and VEGF in NSCLC and metastasis lymphnode tissues were detected by immunohistochemical method respectively, and the difference were done by Image-Pro Plus 6.0 image analysis software. The relationship of S100A4 and VEGF with clinical factors were further analyzed, and the correlation between the tumor angiogenesis of them in NSCLC was analyzed. Results The expression of S100A4 and VEGF proteins in lung squamous cell carcinomas, adenocarcinomas and metastasis lymphnode tissues were significantly higher than in adjacent no-malignant tissues (P<0.05). The expression of S100A4 and VEGF were significantly correlated with TNM stages (P<0.05), and not related with gender, age, tumor size and pathological grade (P>0.05). The expression of VEGF in NSCLC had significant relationship with S100A4 (P<0.05). Conclusion S100A4 and VEGF may play a role in the carcinogenesis, development and metastasis of the non-small cell lung cancer. Both of them have synergistic effect on tumor formation.

S100A4 protein; vascular endothelial growth factor; non-small cell lung cancer; immunohistochemical

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.07.010

上海市金山區(qū)衛(wèi)計(jì)委青年科研項(xiàng)目(No JSKJ-KTQN-2014-16)

201500 上海，上海市第六人民醫(yī)院金山分院1.呼吸科，2.病理科 3. 201501 上海,上海市金山區(qū)眾人老年護(hù)理醫(yī)院內(nèi)科

周敏，E-mail:zhoumin-1209@163.com

2017-02-27]