河湟谷地胃癌患者癌組織生長抑素受體2和CCL7蛋白的表達及臨床意義

馬玉濱 燕 速 于鵬杰 趙林娟

(青海大學附屬醫院胃腸腫瘤外科，青海 西寧 810016)

·腫 瘤·

河湟谷地胃癌患者癌組織生長抑素受體2和CCL7蛋白的表達及臨床意義

馬玉濱 燕 速 于鵬杰 趙林娟

(青海大學附屬醫院胃腸腫瘤外科，青海 西寧 810016)

目的 研究河湟谷地胃癌患者癌組織及癌旁組織中生長抑素受體(SSTR)2和細胞趨化因子(CCL)7蛋白的表達及與臨床病理特征的關系。方法 收集河湟谷地新發胃癌患者癌組織及癌旁組織各60例，免疫組化法檢測SSTR2和CCL7蛋白的表達情況，分析不同臨床病理參數對SSTR2和CCL7陽性表達的影響以及二者表達的相關性。結果 SSTR2在胃癌組的陽性表達率較癌旁組低(P<0.05)；CCL7在胃癌組的陽性表達率較癌旁組明顯升高，均具有統計學意義(P<0.05)。高、中分化胃癌組中SSTR2的陽性表達率明顯高于低分化胃癌組(P<0.05)；有漿膜浸潤、腫瘤直徑大、淋巴結有轉移以及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期者的CCL7陽性表達率均遠遠高于無漿膜浸潤、淋巴結無轉移以及TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期者(P<0.05)。SSTR2和CCL7在胃癌組織中的表達無相關性(P>0.05)。結論 SSTR2的缺失和CCL7的高表達可能促進河湟谷地胃癌的發生。

SSTR2；CCL7；胃癌；河湟谷地

盡管世界大部分地區胃癌的發生率已經有明顯下降，但在我國仍是第二位的癌癥死因，尤其在我國西北部地區〔1，2〕。作為西北青藏高原上的省份之一，青海省平均海拔在3 000 m以上，是我國胃癌的高發地區〔3〕。河湟谷地位于青海省東部，位于黃河上游與湟水河流域之間，海拔相對較低，平均約2 000 m，是青海省主要農業區，人口稠密。研究顯示近10年來河湟谷地胃癌的檢出率及死亡率呈現明顯上升趨勢，且呈現出特殊的流行病學特征——高侵襲性，該地區胃癌具有高病死率主要是因為該地區的進展期腫瘤容易侵犯神經及脈管〔4〕。生長抑素(SST)是一種能夠抑制垂體釋放生長激素的環狀多肽類激素，主要通過5種生長抑素受體(SSTR)發揮作用〔5〕，其中SSRT2還可誘導細胞凋亡，在腫瘤組織中呈低表達，并與患者預后相關〔6，7〕。但對胃癌中SSRT2變化的報道不多，且結果不盡相同〔8～12〕。此外，在腫瘤發生發展中，細胞趨化因子(CCL7)起著重要作用，通過結合腫瘤細胞表面受體CCR1、CCR3增加腫瘤侵襲性〔13〕。但在胃癌方面，僅有1篇報道認為CCL7在胃癌組織中高表達，與患者不良預后有關〔14〕。本文探討SSTR2和CCL7在河湟谷地胃癌患者中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 對2015年3～10月青海大學附屬醫院胃腸外科住院的病人進行篩選，選取世居于河湟谷地、經纖維胃鏡檢查，取病理活檢明確診斷為胃癌，且接受胃癌根切手術者60例，年齡46～75〔平均(55.5±7.1)〕歲，男33例，女27例；腫瘤直徑<5 cm者37例，≥5 cm者23例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期21例；腫瘤組織分化程度：高、中分化組26例，低分化組34例；有淋巴結轉移28例；漿膜浸潤24例。術中取胃癌組織標本及相應癌旁非腫瘤黏膜組織(距腫瘤邊緣>5 cm)置10%～13%甲醛溶液中固定，石蠟包埋備用。

1.2 納入及排除標準 納入標準：性別不限；有完整的臨床病理資料；世居青海省河湟谷地(兩代及兩代以上)；新發原發性胃癌病例；可接受根治性手術治療等。排除標準：接受過放化療治療；合并免疫、神經等系統疾病等。

1.3 實驗步驟

1.3.1 HE染色 ①修整蠟塊，連續勻速切片，每片厚度約4 μm，溫水中展平，放到經過預處理的載玻片上，烘干；②二甲苯及乙醇梯度處理，對石蠟切片進行脫蠟，復水；③蘇木精液染色；④1%鹽酸乙醇分色；⑤自來水浸泡15 min至反藍；⑥將切片置伊紅染色液中1～3 min，蒸餾水稍洗；⑦常規脫水，透明；⑧中性樹脂封片，鏡檢。

1.3.2 免疫組化法 ①切片、脫蠟、復水：同HE染色。②抗原微波修復：枸櫞酸鹽緩沖液微波修復(中低火)10 min，室溫冷卻至常溫，重復一次；3%H2O2，10 min；PBS液洗3次。③封閉：封閉液(PBS，5% BSA+0.3% Triton X-100)室溫孵育1 h。④孵育抗體：加入適量一抗(SSTR-2兔源一抗購自Abcam公司，用封閉液以1∶100稀釋；CCL-7兔源一抗購自SAB公司，用封閉液以1∶20稀釋)4℃過夜，PBS液洗3次；辣根酶標記的二抗(羊抗鼠IgG-HRP，購自Jackson ImmunoResearch，用封閉液以1∶500稀釋)室溫孵育2 h；PBS液洗3次。⑤DAB溶液顯色，觀察至顯色滿意，流動水沖洗終止顯色；⑥蘇木素復染10 s，1%氨水退紫，梯度酒精脫水，二甲苯透明。⑦中性樹膠封片，鏡檢。⑧質量控制：用試劑公司所提供的已知結果為陽性的切片作為陽性對照；陰性對照組則用PBS液替代一抗。

1.4 結果判定 使用隨機選取的5個高倍鏡(×400)進行觀察，統計觀察患者的癌細胞和癌旁正常胃黏膜上皮細胞的陽性細胞數和著色深度，并進行計分。共設定為0～4分，0分代表陰性表達，1分代表陽性表達細胞數≤10%，2分代表陽性表達細胞數在11%～50%，3分代表陽性表達細胞數在51%～75%，陽性表達細胞數超過75%為4分。同時根據陽性細胞表達的著色深度進行區分：0分代表基本不著色，1分代表淡黃

色，2分代表棕黃色，3分代表棕褐色。統計的分數相乘，得數≤3分的計為表達陰性(-)，得數>3的則為表達陽性(+)。

1.5 統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行χ2檢驗或Fisher精確概率法。

2 結 果

2.1 SSTR2和CCL7蛋白在胃癌與癌旁組織中的表達 SSTR2和CCL7蛋白在免疫組化染色中呈現棕褐色顆粒，在細胞質及細胞膜內表達。見圖1。胃癌組織中，SSTR2表達陽性28例(46.7%)，癌旁組織中，SSTR2表達陽性44例(73.3%)，二者差異顯著(χ2=8.889，P=0.003)。胃癌組織中CCL7表達陽性33例(55.0%)；癌旁組織CCL7表達陽性17例(28.3%)，二者差異顯著(χ2=8.777，P=0.003)。見圖2。

圖1 胃癌及癌旁組織HE染色(×400)

2.2 胃癌組織中SSTR2的表達與臨床病理特征的關系 SSTR2在低分化胃癌組織中的陽性表達率較高、中分化胃癌組織明顯降低(P<0.05)；SSTR2的陽性表達與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期均無關(P>0.05)。見表1。

2.3 胃癌組織中CCL7的陰性表達與臨床病理特征的關系 胃癌患者中CCL7的陽性表達與性別、年齡、腫瘤分化程度無明顯的關系(P>0.05)，與腫瘤大小、癌組織浸潤程度、淋巴結轉移、TNM分期有關(P<0.05)。見表1。

2.4 SSTR2和CCL7在胃癌中表達的相關性 在SSTR2表達陽性的胃癌組織中，CCL7陽性表達率為60.7%(17/28)，在所有SSTR2的表達為陰性胃癌組織中，CCL7陽性表達率為50.0%(16/32)，差異無統計學意義(χ2=0.693,P=0.405)，表明二者在胃癌組織中的表達無相關關系。

3 討 論

對于胃癌組織中SSTR2的研究不多，結果也有出入。武華等〔8〕研究指出，SSTR的表達具有多樣性，多種亞型SSTR可以在胃癌組織和胃良性組織中檢測出表達結果，而SSTR2在胃癌組織中表達比較低，但與患者性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期均未見明顯相關；與高分化胃癌相比，低分化胃癌組織中SSTR的表達降低，但無統計學意義(P>0.05)。江興松等〔9〕認為SSTR2與胃癌有無淋巴結轉移及胃癌分化程度有關。但楊曉莉等〔10〕則發現SSTR2在胃癌及癌旁組織均低表達，差異無統計學意義。范學科等〔11〕在基因和蛋白水平的研究得出同樣結論。梁君銘等〔12〕則表明，SSTR2在胃正常組織的陽性表達率明顯高于胃癌組織，該差異具有統計學意義(P<0.05)。Liu等〔13〕也有類似發現，且在胃癌組織中尤其是低分化的胃癌組織中SSTR的表達相對更低。CCL7是CC趨化因子亞族一員，主要在內皮細胞、單核細胞、腫瘤細胞等表達，進入內質網后經過系列的加工和修飾，分泌至胞外，發揮的作用包括趨化作用、引發鈣內流、肝素結合等〔14〕。免疫組化法和RT-PCR法顯示大腸癌肝轉移中，腫瘤細胞CCL7的表達明顯高于正常腸上皮細胞，推測CCL7在促進腫瘤遠處轉移中起到相當重要的作用〔15〕，對于胃癌與CCL7相關性的報道很少。

本文結果提示SSTR2的缺失可能在胃癌的發生發展中起到一定作用。SSTR2屬于特異性的生長抑素受體，受SST、SSTA激活后可能通過環腺苷酸、促分裂原活化蛋白激酶、鈣離子依賴性蛋白激酶等途徑發揮抑制腫瘤細胞增殖的作用；也可通過抑制促腫瘤生長的細胞因子或激素的合成與分泌，阻滯細胞周期，抑制腫瘤血管形成〔6，7〕。因此推測由于SSTR2的低表達，影響了上述信號轉導途徑，SST抑制胃黏膜細胞增殖的能力下降，凋亡細胞減少，這可能是胃癌發生的原因之一。此外，本研究還發現SSTR2在河湟谷地胃癌組織中的低表達與分化程度密切相關，分化程度越高，SSTR2陽性表達率越高，而與其他臨床病理因素無關。據此認為，胃癌的惡性程度與SSTR2有關聯，且SSTR2可能具有調控胃癌組織分化的作用，在胃癌的發展中起到一定作用。然而研究發現，SSTR2在胃癌中的表達與其是否存在淋巴結轉移無關，與江興松等〔9〕的結論相悖，這有待大樣本數據的進一步確認。

本文提示CCL7的表達上調可能在胃癌的侵襲及轉移過程起到了一定的作用，這與Hwang等〔14〕的研究結果相同。惡性腫瘤的侵襲是一個復雜的過程，多數情況下，與細胞外基質和腫瘤細胞周圍結締組織的降解及破壞有關，而CCLs表達水平的增加可募集髓樣細胞至腫瘤病灶處，這些髓樣細胞分泌MMP9、MMP2，可通過破壞組織學屏障、促進新生血管形成等促進腫瘤侵襲和轉移。本研究提示CCL7在胃癌的進展及侵襲轉移中發揮一定作用。

此外，SSTR2和CCL7在胃癌患者中的表達無相關關系，可能二者在胃癌中表達受到的影響因素不同，也可能是本次實驗選取的樣本較少或使用的實驗方法不同導致。因此，下一步擬擴大樣本量，應用PCR法從DNA水平驗證，并通過基因轉染及免疫印跡法探討SSTR2和CCL7在胃癌侵襲及轉移中可能涉及的信號途徑。

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〔2017-03-15修回〕

(編輯 曹夢園)

馬玉濱(1979-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事胃腸道腫瘤研究。

R735.2

A

1005-9202(2017)11-2713-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.049