補腎益氣方對血管內皮細胞p16基因表達的影響

湯江泉+張毅

【摘要】 目的 研究補腎益氣方對大鼠血管內皮細胞p16基因表達的的影響。方法 24只健康雄性SD大鼠， 隨機分為中藥組（補腎益氣方灌胃）、黃芪組（黃芪水煎液灌胃）、生理鹽水組（生理鹽水灌胃）， 各8只。提取含藥血清， 培養人臍靜脈內皮細胞株， 采用β-半乳糖苷酶（β-gal）染色鑒定細胞衰老；流式細胞術分析細胞周期變化， 用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR） 方法檢測p16基因的表達。結果 中藥組、黃芪組G0/G1期細胞比例（63.18±1.07）、（71.73±1.32）%小于生理鹽水組（79.56±2.88）%， 中藥組G0/G1期細胞比例小于黃芪組， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）。中藥組、黃芪組mRNA灰度值/β-肌動蛋白（β-actin） 灰度值比值（0.1231±0.0064）、（0.1835±0.0057）小于生理鹽水組（0.5126±0.0110）， 中藥組mRNA灰度值/β-actin灰度值比值小于黃芪組， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）。結論 補腎益氣方具有延緩血管內皮細胞凋亡的作用， 其分子機制可能通過調控p16的表達使細胞周期停滯于G1 期發揮作用， 具有一定參考價值。

【關鍵詞】 補腎益氣方；血管內皮細胞；p16基因；中藥

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.14.111

【Abstract】 Objective To study the impact of Bushen Yiqi prescription on p16 gene expression in vascular endothelial cells of rats. Methods A total of 24 healthy male SD rats were randomly divided into traditional Chinese medicine group （gavage of Bushen Yiqi prescription）， astragalus group （gavage of astragalus water decoction） and normal saline group （gavage of normal saline）， with 8 rats in each group. Drug-containing serum was extracted to cultivate human umbilical vein endothelial cell strain， and β- galactosidase （β-gal） dyeing was used to identify cell aging. Cell cycle changes was analyzed by flow cytometry， and p16 gene expression was detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results The traditional Chinese group and astragalus group had G0/G1 phase cell proportion as （63.18±1.07） and （71.73±1.32）%， which were less than （79.56±2.88）% in normal saline group， and the traditional Chinese group had less G0/G1 phase cell proportion than astragalus group. Their difference had statistical significance （P<0.05）. The traditional Chinese group and astragalus group had mRNA gray value/β-actin gray value ratio as （0.1231±0.0064） and （0.1835±0.0057）， which were less than （0.5126±0.0110） in normal saline group， and the traditional Chinese group had less mRNA gray value/β-actin gray value ratio than astragalus group. Their difference had statistical significance （P<0.05）. Conclusion Bushen Yiqi prescription plays a role in delaying vascular endothelial apoptosis， and its molecular mechanism may regulate the expression of p16 to stagnate the cell cycle at G1 phase， along with certain reference value.

【Key words】 Bushen Yiqi prescription； Vascular endothelial cells； p16 gene； Traditional Chinese medicine

相關臨床資料表示， 出現動脈粥樣硬化或者是心血管事件發生情況的危險因素一般為年齡增長， 而隨著人們的年齡逐漸增長， 自身的機能也會逐漸的變化， 出現較多的血管衰老等現象， 而為了能夠研究血管內皮細胞所實施的凋亡一般是我國對動脈粥樣硬化病理生理的一種機制， 也算是出現動脈粥樣硬化的因素[1， 2]。本文研究中， 作者主要觀察大鼠血管內皮細胞是否會出現凋亡作用， 并將其試驗結果進行統計分析， 詳情如下。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 藥物 補腎益氣方， 藥方組成：熟地20 g、山茱萸20 g、補骨脂15 g、白參15 g、枸杞子15 g、淫羊藿15 g、黃芪30 g。

1. 1. 2 試劑與儀器 流式細胞儀FACScan（BD公司， 美國）、GeneAmpPCRSystem9700 擴增儀（PE公司， 美國）、UVP凝膠成像及分析系統（UVP公司， 英國）。

1. 1. 3 實驗動物 選取24只健康雄性SD大鼠， 體重為（200±10）g。

1. 1. 4 實驗細胞 人臍靜脈內皮細胞株（ATCC公司）。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 實驗分組 將24只健康雄性SD大鼠通過動態化隨機分組的方法分為中藥組（補腎益氣方灌胃）、黃芪組（黃芪水煎液灌胃）、生理鹽水組（生理鹽水灌胃）， 各8只。分別給予三組大鼠實施所在組別的治療方法， 2次/d ， 共治療8 d。接著取出大鼠的腹主動脈血液， 將其存放在已經高溫消毒后的玻璃管里， 然后對其進行離心， 取出上清液， 接著凍存、管裝， 在冰箱中保存， 進行試驗時對其進行30 min滅活處理。

1. 2. 2 細胞培養 將培養基中的血清在培養箱中逐漸的進行培養， 需要時刻觀察其情況， 在第2～3天需要密切對其進行換液培養， 從而進一步維持一個較為良好的生長狀態。然后將三組已經采集后的血清分別放進培養液中進行培養。

1. 2. 3 細胞周期測定 將三組的細胞進行胰蛋白酶消化， 之后將其進行收集。

1. 2. 4 RT-PCR方法測定p16基因mRNA表達 對三組一般選用第56代作為衰老細胞凍存細胞進行試驗。

1. 3 統計學方法 采用SPSS22.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 細胞周期 中藥組、黃芪組G0/G1期細胞比例（63.18±1.07）、（71.73±1.32）%小于生理鹽水組（79.56±2.88）%， 中藥組G0/G1期細胞比例小于黃芪組， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）。見表1。

2. 2 p16基因表達 中藥組、黃芪組mRNA灰度值/β-actin灰度值比值（0.1231±0.0064）、（0.1835±0.0057）小于生理鹽水組（0.5126±0.0110）， 中藥組mRNA灰度值/β-actin灰度值比值小于黃芪組， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）。見表2。

3 討論

相關臨床資料表示[3， 4]， 人們總會隨著時間的變化導致自身機體出現衰老的現象， 而衰老也是臨床各種系統性生理性的一種表現， 當患者的年齡出現逐漸增長的現象后， 其會出現較多老年疾病， 同時患者自身的心血管疾病的發生幾率也會逐漸上升。

血管內皮細胞是患者自身血管內側中較多的一種多功能細胞， 主要是能夠起到促進平滑肌細胞增殖的作用， 而我國現今臨床一直在采用動物實驗來進行研究， 主要是通過動物實驗的研究將研究的情況進行統計分析， 之后再根據研究的結果進行判斷[5， 6]。

p16基因是一種細胞周期中的基本基因， 可以在一定的程度上有效抑制細胞周期蛋白的結合， 還能夠使得細胞分裂逐漸出現減少的現象， 進一步抑制細胞的增值效應， 效果較佳。相關臨床資料表示[7， 8]， 當p16基因出現了衰老表型， 那么就表示p16基因是一種細胞凋亡中的關鍵調控基因， 而p16蛋白會成為調控的中心環節， 從而在一定的程度上抑制細胞增殖且引起患者出現細胞衰老的變化情況。

隨著社會的發展以及臨床醫學的逐漸變化， 臨床上的中醫藥對于衰老也取得了一定的臨床研究數據， 較多學者認為， 人的機體會出現衰老現象， 其主要是因為患者的中壽而盡與瘀血內阻具有一定的關系， 在患者出現腎陰虛血少的情況下， 導致陰血不足， 很有可能會出現血瘀的情況， 從而加速患者出現衰老的現象[9， 10]。

本文研究結果表示， 中藥組、黃芪組G0/G1期細胞比例（63.18±1.07）、（71.73±1.32）%小于生理鹽水組（79.56±2.88）%， 中藥組G0/G1期細胞比例小于黃芪組， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）。中藥組、黃芪組mRNA灰度值/β-actin灰度值比值（0.1231±0.0064）、（0.1835±0.0057）小于生理鹽水組（0.5126±0.0110）， 中藥組mRNA灰度值/β-actin灰度值比值小于黃芪組， 差異均具有統計學意義 （P<0.05）。表明黃芪組能夠有效延緩細胞的凋亡現象， 從而起到一定的研究效果， 同時， 從本文研究結果中還可以看出， 采用補腎益氣中藥遠遠要比黃芪的作用更加的明顯。

綜上所述， 補腎益氣方可以有效延緩血管內皮細胞的凋亡情況， 在一定的程度上能夠發揮抗動脈粥樣硬化的作用， 具有一定的參考價值。

參考文獻

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[收稿日期：2016-12-12]