MicroRNAs與異種移植

趙智成

摘要：MicroRNAs是一種普遍存在的非編碼單鏈RNA，廣泛參與眾多的生物學過程，特別是對免疫系統能夠進行精細調節和定量調節。異種移植是治療臟器功能衰竭的希望。研究MicroRNAs在免疫調節應答中的作用，將為防治移植排斥反應提供新的途徑。

關鍵詞：MicroRNAs；異種移植；免疫調節；排斥反應

中圖分類號：R392.4 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）13-0044-03

1 MicroRNAs的研究現狀

近年來測序技術、生物信息學以及基因組學的飛速發展帶來了巨量的遺傳信息，使人們認識到基因表達和調節機制的重要性。1993年，Lee等在秀麗新小桿線蟲中發現了第一個可時序調控胚胎后期發育的基因lin-4[1]。2000年，Reinhart等又在該線蟲中發現第二個異時性開關基因let-7[2]。2001年10月《Science》報道了三個實驗室分別從線蟲、果蠅和人體內找到的幾十個類似于lin-4的小RNA基因，稱之為MicroRNAs。在過去的十年中，MicroRNAs作為細胞基因調節網絡的核心元件這一事實越發的清晰。MicroRNAs家族是一類內源性、非編碼、單鏈RNA，長約22個核苷酸，作為一種轉錄后的基因調節因子而廣泛存在于從病毒、線蟲、植物到動物體內。MicroRNAs通過和匹配的互補mRNA結合或促進靶mRNA降解來阻斷翻譯過程進而抑制蛋白的合成。MicroRNAs被一組的基因編碼，在細胞核內表達，經過一系列的加工變為長為19～25核苷酸的成熟體。首先在核內，較長的包含特征性發卡結構的MicroRNAs初級轉錄產物（primary MicroRNAs）被RNA聚合酶II轉錄并被核糖核酸酶III、Drosha內切酶及Parsha/DGCR8加工成70個核苷酸左右并能形成莖環結構的前體（pre-MicroRNAs）[3]。而后，pre-miRNAs被轉運子5轉移到胞漿內，并被Dicer酶及其配體TAR RNA結合蛋白（TRBP）加工成22核苷酸的雙鏈RNA。雙鏈RNA解離后形成有功能的、成熟的MicroRNAs單鏈，后者與包括Argonaute族在內的眾多蛋白組成RNA介導的沉默復合體（RISC），從而發揮抑制靶mRNA轉錄及促進其降解的作用。揭開MicroRNAs的沉默翻譯網絡之謎在某種程度上仍是一項挑戰，這是因為一種MicroRNAs可以抑制多種靶mRNA，同時一種mRNA又接收多種相互合作的MicroRNAs的調控。與之相應，盡管已知MicroRNAs的表達、功能失調與多種人類腫瘤和自身免疫性疾病相關，但對于MicroRNAs的調控機制我們仍然知之甚少。其直接參與了廣泛的生物學過程，包括生長發育、造血、細胞分化、凋亡及增殖。迄今為止，超過800種人類MicroRNAs被鑒別，而只有其中一小部分的生物學功能被闡明。到目前為止，通過某些計算機手段預測出來的MicroRNAs約多達1000個甚至可能更多，大約覆蓋了3%人類基因組序列[4-6]。

2 MicroRNAs的鑒別和檢測

鑒別和檢測MicroRNAs的三項主要技術：總MicroRNAs測序、總MicroRNAs芯片檢測及實時定量PCR（qPCR）對于假定MicroRNAs的直接檢測。測序最為敏感，可發現新的MicroRNAs。常規cDNA克隆后測序和深度測序[7]被用于鑒別新MicroRNAs。存在多種MicroRNAs芯片如MicroRNAs微芯片、qPCR芯片，盡管它們只能用于已知MicroRNAs的檢測[8-11]，商品化的試劑盒可被有效用于基于雜交和qPCR的MicroRNAs表達分析。最后，直接的qPCR用于對已知MicroRNAs的快速檢測。帶有莖環的逆轉錄引物增加了對于MicroRNAs檢測的特異性及敏感性[12]。

3 MicroRNAs的功能

3.1 MicroRNAs功能與表達的關系

MicroRNAs的功能分析主要包括對MicroRNAs表達的調節和對靶mRNA表達的影響。慢病毒及逆轉錄病毒載體常被用于高表達MicroRNAs，而后對其靶mRNA的表達進行分析[13]。常用的策略是使用含有MicroRNAs靶序列的熒光素酶報告系統來檢測過表達pri-miRNA或用shRNA、siRNA抑制時靶mRNA的表達情況。其它減低MicroRNAs表達的方法還有MicroRNAs基因敲除和序列特異性的MicroRNAs拮抗物[14]。絕大多數MicroRNAs的靶mRNA還不清楚，確定某一特定的MicroRNAs的靶基因及結合位點仍是一大挑戰。基因芯片和靶基因預測軟件可用于這一工作[15-16]。據估計至少有一半表達的mRNA被MicroRNAs所調控[17]。通過熒光素酶報告系統，這些mRNA將被確認其非翻譯區（UTRs）是否被特定的MicroRNAs所調控[18]。而MicroRNAs在人工系統中能夠調節某一mRNA并不能說明在體內后者是前者功能相關的靶mRNA[19]。

3.2 MicroRNAs功能與免疫系統調節的關系

動物免疫系統在應對感染、內環境穩定和免疫方面發揮重要作用。為了達到免疫反應和免疫耐受的適當平衡，免疫反應的開始、結束和反應強度必須被嚴密調節。相較于轉錄子全開或全閉的調節方式，MicroRNAs更適合對免疫系統進行精細和定量的調節。因為它們都是通過極短的作用位點進行調節，在對應位點一個或幾個堿基對就可以起到關鍵的作用，并且因為它們在進化中易于突變，從而為生物提供了隨病原體變化同時又發揮作用的基因調節庫。最近研究表明MicroRNAs在免疫系統的精密調控中發揮了重要作用。深入理解免疫系統被MicroRNAs調節的機制，不僅有利于尋找調節免疫的新靶標，也有利于創造MicroRNAs有效地新療法。MicroRNAs在免疫系統發育及功能中起到了關鍵作用。某些特定MicroRNAs對B細胞、T細胞分化，先天及獲得性免疫，T細胞受體（TCR）通路，toll樣受體（TLR）通路，調節性T細胞（Treg）功能，抗原的表達及細胞因子的產生都具有巨大影響。因此，MicroRNAs參與了免疫的各個方面并可以決定移植物的排斥與耐受，盡管這一論點須在移植模型中作進一步證實。

4 異種移植的排異反應

器官移植已成為臟器功能衰竭的一種重要療法，環孢素等抗排斥藥物的出現以及手術技術的進步使器官移植取得了里程碑式的進展。然而，移植供體日漸缺乏。臨床上如果能夠開展異種移植，則可為患者提供大量的供體，移植技術也將得到極大的推動。異種移植完成后受體將表現出比同種移植更為復雜而強烈的排異反應。包含：超急性排斥反應（hyperacute rejection，HAR）、急性血管性排斥反應（acute vascluar rejection，AVR）、急性細胞性排斥反應（acute cellular rejection，ACR）等。其中，HAR主要由半乳糖α1，3-半乳糖抗原（Galα1，3Gal）所引發，而急性血管排斥反應和急性細胞排斥反應與核轉錄因子-κB（NF-κB）有著密切關系。AVR發生于HAR后，又稱延遲移植排斥反應（delayed xenograft rejection，DXR），AVR有2個特點，其一是激活血管內皮細胞以及單核細胞浸潤，很少出現T細胞或缺少T細胞，表明AVR并不依靠補體參加。此反應是通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用以及供體內皮細胞活化等幾種機制來完成。有研究證明，3個因素或許參與AVR的發生、發展：天然異種抗體、繼發抗體的結合、激活的供體內皮細胞和針對異源組織的NK細胞活化。

5 MicroRNAs與異種移植的關系

當我們開始認識到MicroRNAs在參與免疫應答中有怎樣的特異性時，有證據表明MicroRNAs參與了整個免疫穩態和自身耐受的維持。此外，MicroRNAs表達的方式和水平依淋巴細胞的分化和活化而進行高度調節。既然特定基因的表達模式可以作為移植物排斥或耐受的標志，那么有理由認為MicroRNAs表達的變化便是這種模式的基礎。Suthanthiran的研究小組測定了365種MicroRNAs在7份同種異體腎移植物活檢標本中的表達模式并分析了特定MicroRNAs在其它33份標本（12份急排、21份正常）的表達情況。聚類分析表明急排組與正常組有差異。17種MicroRNAs在急排活檢標本和正常對照間表達有差異。與正常對照相比，10種低表達，7種高表達。miR-142-5p，miR-155和miR-223高度提示急排并且與移植物內CD3 mRNA水平相關。miR-155被證明與抗體、細胞因子產生，TLR信號通路，Treg細胞生成相關，而所有這些都關系到同種異體移植物排斥反應。這3個MicroRNAs基因簇位點是：miR-648、miR-185、miR-130b同位于染色體22q11，21；miR-510、miR-513位于染色體xq27，3；miR-370、miR-494、miR-134、miR-433位于染色體14q32，31。通過軟件TargetsScan可以預測差異表達顯著的MicroRNAs靶基因，從中尋找慢性排斥的可能影響因子進行進一步的研究探索。由此可見，MicroRNAs在移植排斥反應中發揮著重要的調控作用。

6 小結

未來幾年的研究工作將集中在闡明特定MicroRNAs的靶基因及其生物學重要性。在這一領域的進展無疑將使我們對于免疫應答的理解更近一步從而為器官移植提供了新的靶點和途徑。事實上，靜默靶MicroRNAs的相關策略已經被開發-即使用“拮抗mirs”，一種與靶MicroRNAs互補的膽固醇結合的單鏈RNA寡核苷酸。其它的方法包括使用載體介導的MicroRNAs靶序列誘導并耗竭內源性的mRNAs。另外，使用腺病毒載體替代靶MicroRNAs的方法對鼠肝細胞癌模型起到了治療作用。未來對MicroRNAs在調節免疫應答中表達和功能的進一步認識必將為促進移植物長期存活提供新的可能性。

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編輯/成森