糖尿病胃輕癱大鼠胃平滑肌細胞凋亡相關蛋白Bcl—2與Bax的表達與意義

張聞達

摘要：目的 觀察Bcl-2與Bax在糖尿病胃輕癱大鼠胃平滑肌細胞中的變化，探討其在糖尿病胃輕癱發生中的意義。方法 成年SD大鼠20只，鏈脲佐菌素（STZ）誘導制備糖尿病大鼠模型，另取20只作為正常對照組，飼養6 w后處死取胃組織。利用免疫組織化學染色檢測胃平滑肌組織Bcl-2與Bax的表達。結果 正常對照組Bcl-2顯色指數（5.68±3.24）；糖尿病組Bcl-2顯色指數（1.58±0.72）；兩組比較有明顯差異P<0.01。而Bax在正常對照組顯色指數（1.74±0.75）；在糖尿病組顯色指數（5.75±2.12），兩組比較有明顯差異P<0.01。結論 Bcl-2 與Bax表達的變化可能在糖尿病胃輕癱的發生中發揮重要作用。

關鍵詞：糖尿病；胃輕癱；Bcl-2；Bax；表達

中圖分類號：R587.1 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）13-0083-02

Abstract：Objective To observe the changes of Bcl-2 and Bax in gastric smooth muscle cells of diabetic gastroparesis rats，and to explore the significance of Bcl-2 and Bax in the pathogenesis of diabetic gastroparesis.Methods 20 adult SD rats， streptozotocin（STZ）induced by preparation of diabetic rat model，another 20 rats as normal control group，feeding 6 w were obtained by the expression of gastric tissue.Immunohistochemical staining of Bcl-2 and Bax in gastric smooth muscle tissue.Results The normal control group Bcl-2 color index（5.68±3.24）；diabetes mellitus group Bcl-2 color index（1.58±0.72）；there was significant difference between the two groups，P<0.01.But Bax in the normal control group the color index（1.74±0.75）；In diabetic group，the color rendering index（5.75±2.12）was significantly different between the two groups.P<0.01.Conclusion Bcl-2 and Bax expression may play an important role in the development of diabetic gastroparesis.

Key words：Diabetes mellitus；Gastroparesis；Bcl-2；Bax；Expression

胃輕癱是糖尿病常見的慢性并發癥之一，主要表現為胃動力低下、胃排空延遲、胃轉運時間延長等引起的腹脹、惡心、嘔吐等。至今糖尿病所致胃輕癱的機理仍不完全清楚[1]。Bcl-2與Bax共屬于一個家族，通過控制線粒體膜的通透性來調節凋亡激活物。bax二聚體在膜上打開通道，增加通透性；bcl-2與bax形成異聚體，降低通透性。所以，bcl-2水平的升高和bax的降低表明細胞對凋亡的抵抗性增強，應該是保護藥物起作用的標志；而反之則相反。研究發現，糖尿病大鼠成模6 w后出現胃輕癱機體癥狀，并發生胃平滑肌細胞凋亡[2]。為探討Bcl-2與Bax在糖尿病胃輕癱中的變化及作用，本實驗以糖尿病胃輕癱模型大鼠為研究對象，觀察了胃平滑肌細胞的Bcl-2與Bax蛋白與基因的表達，旨在進一步闡明糖尿病胃輕癱的發生機制，為臨床探索新的治療方案提供科學的理論依據與實驗依據。

1 材料與方法

1 材料與試劑

成年SD雄性大鼠40只，雌雄不限，體重200～220 g，由延邊大學實驗動物中心提供。鏈脲佐菌素（STZ）（SIGMA），Bcl-2、Bax抗體（Cell Signaling），即用型SABC免疫組化試劑盒（博士德），小量柱離心式組織總RNA提取純化試劑盒（華舜）；PremixTaqR TaqTMVersion（寶生物）；Wizard〗〗（#A7170）純化試劑盒（Promega）；一步法RT-PCR試劑盒（Promega）。

1.2方法

1.2.1模型制備與分組 實驗分為模型組和正常對照組，每組20只。0.1 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液（pH4.0）配制成0.5%的STZ溶液；大鼠禁食不禁水12 h，稱重；將STZ用0.1 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液（pH4.0）配制成0.5%的STZ溶液；糖尿病組大鼠一次性腹腔注射65 mg/Kg STZ，制備糖尿病大鼠模型。正常對照組一次性腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液。給藥1 w后，采尾部靜脈血測定血糖濃度，血糖濃度高于350 mg/dl大鼠確定為造模成功。所有大鼠均單籠飼養，自由進食和飲水，于飼養6 w后處死用于實驗。

1.2.2免疫組織化學法觀察Bcl-2與Bax蛋白 采用S-P法檢測兩組實驗大鼠為平滑肌Bcl-2與Bax的表達情況。雙盲法選取實驗用每張切片不同部位隨機觀察五個400倍視野，分別記錄顯色程度和顯色范圍。顯色程度分弱+、中++、強+++表示。顯色范圍分：顯色范圍占高倍視野<1/4為+，占1/4～2/4為++，占2/4～3/4為+++，>3/4為++++。然后將每個高倍視野顯色程度和范圍換算成“顯色指數”。顯色指數=顯色程度×顯色范圍（+，++，+++，++++分別按1，2，3，4分計算）。取均數為每一種類蛋白表達的最終顯色指數。

1.3統計學處理

實驗數據應用SPSS 16.5統計軟件包進行統計分析。所有數據采用（x±s）表示，計量資料采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01為差異具有顯著的統計學意義。

2 結果

2.1兩組大鼠胃平滑肌Bcl-2蛋白的表達

免疫組化法結果顯示，正常對照組胃平滑肌細胞Bcl-2呈散在分布的棕色顆粒，顯色指數（5.68±3.24）；糖尿病組胃平滑肌細胞Bcl-2未見明顯棕色顆粒，顯色指數（1.58±0.72）；兩組比較有明顯差異（P<0.01），見圖1。

2.2兩組大鼠胃平滑肌Bax蛋白的表達

免疫組化法結果：Bax在正常對照組胃平滑肌細胞未見明顯棕色顆粒，顯色指數為（1.74±0.75）；在糖尿病組胃平滑肌細胞Bax呈散在分布的棕色顆粒，顯色指數（5.75±2.12），兩組比較有明顯差異（P<0.01），見圖2。

3 討論

糖尿病胃輕癱的發生是一個復雜的病理生理過程。目前，關于糖尿病胃輕癱發病機制的研究，主要集中在高血糖造成的神經性病變、胃激素分泌障礙、應激以及部分細胞第二信使的變化等方面，而關于細胞凋亡及其調控的研究，少見報道。細胞凋亡可以通過兩種途徑被介導：線粒體凋亡途徑和死亡受體介導的途徑。這其中細胞色素C的釋放是一個十分重要的事件。許多學者認為線粒體細胞色素C的釋放是通過通透性轉變氣孔，而Bcl-2家族蛋白直接調節PTP。在這些蛋白中，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-Xl能夠保存膜電位，阻斷細胞色素C的釋放；而Bax、Bcl-Xs、Bak、Bid和Bad是前凋亡蛋白，它們通過影響PTP而消除了線粒體的膜電位，促進細胞色素C的釋放。細胞凋亡可受多種細胞因子誘導與調控。同一組織或細胞受不同因子的作用其反應結果不盡相同，同一細胞因子也可受不同的因子影響表現出不同的生物學效應[3]。Bcl-2 與Bax蛋白是上述凋亡調控蛋白中研究較多的蛋白。研究發現Bax/Bcl-2 兩蛋白之間的比例關系是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素，因此認為，bax 是極重要的促細胞凋亡基因之一。

高血糖是糖尿病的特征性臨床表現，也是糖尿病并發癥發生的基礎。它能夠使細胞發生氧化應激和代謝障礙，造成缺氧、氨基酸水平降低、低ATP或AMP增多等。研究發現，細胞的上述變化可誘導細胞凋亡的發生[4]。為了探討Bcl-2 與Bax在糖尿病胃輕癱發生過程中的作用。本實驗首先制備了糖尿病大鼠模型，并利用免疫組織化學染色法觀察了Bcl-2 與Bax蛋白的表達，結果發現糖尿病狀態下Bcl-2表達下降，而Bax表達升高[5]。結果表明，糖尿病狀態下胃平滑肌細胞可能出現了細胞凋亡。同時這結果也表明，Bcl-2 與Bax參與糖尿病胃輕癱的發生，并可能調控細胞凋亡。

參考文獻：

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[2]張默函，姜京植，蔡英蘭，等.糖尿病胃輕癱大鼠胃平滑肌細胞凋亡與IGF-1 PI3K AKT信號通路的動態變化及意義[J].中國糖尿病雜志，2015，23（11）：1023-1026.

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編輯/王朵梅