FPTⅢ對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞分泌IL-6及Rantes的影響

李娜 邱晨 荀安營 季樂財 卓宋明

FPTⅢ對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞分泌IL-6及Rantes的影響

李娜 邱晨 荀安營 季樂財 卓宋明

目的 觀察FPTⅢ對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞（ASMCs）分泌IL-6及Rantes的影響。方法 建立大鼠哮喘模型，采用酶消化法培養ASMCs，并經免疫組織化學、免疫熒光鑒定。取第3代ASMCs，設哮喘組、對照組，各分成5個亞組：對照空白組（不加任何干預劑）、對照PBS組（加入PBS）、對照誘導組（加入10ng/ml IL-1β、TNF-α、IFN-γ混合液）、對照干預A組（加入10μM的FPTⅢ）、對照干預B組（加入混合物刺激物24h，再加入10μM的FPTⅢ）；哮喘空白組、哮喘PBS組、哮喘誘導組、哮喘干預A組、哮喘干預B組，干預方式與對照組相同。采用ELISA法檢測各組ASMCs分泌IL-6及Rantes水平。 結果 α-Actin經熒光染色后呈綠色熒光，哮喘空白組較對照空白組熒光強度減弱。哮喘干預A、B組ASMCs分泌IL-6、Rantes水平均明顯低于哮喘空白組（均P＜0.05），且抑制效應呈時間依賴性。FPTⅢ濃度達5～10μM時，抑制作用達到最大。 結論 FPTⅢ干預可以使哮喘大鼠ASMCs分泌IL-6及Rantes減少，伴隨細胞內α-Actin的變化，進一步導致細胞表型發生變化，為哮喘治療提供新思路。

氣道平滑肌細胞 FPTⅢ 哮喘

哮喘是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥[1]，氣道重塑是慢性炎癥的結構基礎，氣道平滑肌細胞（ASMCs）是重要的結構及功能細胞。ASMCs的增生肥大是哮喘氣道重塑的顯著特征之一，同時伴隨著細胞表型轉化發生。表型轉化指細胞形態上發生改變的同時伴隨合成分泌功能的改變。研究表明，p21Ras介導包括MAPK、PI3K在內的多條信號轉導途徑[2]，它是哮喘氣道炎癥中的重要調節因子。FPTⅢ是法尼基蛋白轉移酶抑制劑，可特異性阻止p21Ras蛋白定位于細胞膜，10μM時即可產生明顯的抑制效果[3]。本實驗采用FPTⅢ特異性阻止Ras定位，進而阻斷其生物學效應，并改變FPTⅢ的作用時間及劑量，觀察它對哮喘大鼠ASMCs分泌IL-6及Rantes的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 成年SPF級SD雄性大鼠8只，6～8周齡，體重150～180g，由南方醫科大學實驗動物中心提供。卵清蛋白（OVA）、鼠抗平滑肌α-Actin單克隆抗體均購自美國Sigma公司；DMEM干粉培養基、標準胎牛血清均購自美國Gibico公司；D-Hanks干粉購自美國HyClon公司；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中山生物技術有限公司；p21Ras抑制劑FPTⅢ購自美國Calbiochem公司；FTIC標記山羊抗小鼠IgG、大鼠IL-6 ELISA試劑盒均購自美國Bender MedSystems公司；大鼠Rantes ELISA試劑盒購自美國R&B公司；IL-1β、TNF-α、IFN-γ均購自美國peprotech公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及模型制備[4-5]將8只大鼠按體重編號，采取隨機數字表法分為兩組，即哮喘組、對照組各4只。第1、8天，哮喘組腹腔注射10%OVA致敏液1ml，對照組注射等體積的0.9%氯化鈉溶液；第15天起，將大鼠置于一密閉的有機玻璃容器（40cm×30cm×20cm）中，哮喘組用超聲霧化器予1%OVA激發液霧化吸入，對照組予等量 0.9%氯化鈉溶液霧化吸入；1次/d，30min/次，連續4周。

1.2.2 大鼠ASMCs的培養及純化 參照Deng等[6]的方法加以改進，造模完成24h內處死大鼠。無菌分離氣管、支氣管，去內、外膜，將組織剪成1mm×1mm的組織塊；加入0.2%Ⅰ型膠原酶，37℃消化30min；加入含20%胎牛血清的DMEM培養液。5～7d后傳代培養，取第3代細胞用于后續實驗。

1.2.3 大鼠ASMCs的鑒定 （1）免疫組織化學法：將第3代細胞按1×105個/ml接種于無菌蓋玻片上，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，步驟參照試劑盒，晾干后中性樹膠封片。（2）免疫熒光法：將第3代細胞按1×104個/ml接種于無菌蓋玻片上，貼壁后取出，4%多聚甲醛固定20min，沖洗3min×3次；0.1%TritonX-100室溫下滲透10min，PBS沖洗；滴加封閉山羊血清，室溫孵育15min；滴加小鼠抗大鼠α-Actin抗體按1∶400稀釋，37℃孵育3h，PBS沖洗，3min×3次；滴加FITC標記山羊抗小鼠熒光二抗（按1∶300稀釋），室溫孵育30min，PBS沖洗；在倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡下觀察α-Actin的分布及含量；激發波與放射波波長分別為490、520nm。

1.2.4 ASMCs處理 取兩組經鑒定的ASMCs。其中對照組分為5個亞組：對照空白組（不加任何干預劑）、對照PBS組（加入PBS）、對照誘導組（加入10ng/ml IL-1β、TNF-α、IFN-γ混合液）、對照干預A組（加入10μM的FPTⅢ）、對照干預B組（加入混合物刺激物24h，再加入10μM的FPTⅢ）。哮喘組分為5個亞組：哮喘空白組、哮喘PBS組、哮喘誘導組、哮喘干預A組、哮喘干預B組；各組干預方式與對照組相同。加入處理因素前24h換成含0.1%FCS的培養基培養，細胞上清液均于上述因素施加24h后收集。

1.2.5 時間、濃度效應的處理 將哮喘空白組細胞以1×105個/ml接種于24孔板中，貼壁后換用無血清培養基培養，分析不同預因素對ASMCs分泌功能的影響。按5、10、20、30、40M不同濃度加入p21Ras抑制劑作用24h，收集上清液，分析FPTⅢ的濃度效應；加入FPTⅢ10μM，于0、24、48、72h不同時段收集上清液，分析FPTⅢ的時間效應。

1.2.6 檢測方法 采用ELISA法測定ASMCs分泌IL-6、Rantes水平，均參照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學處理 應用SPSS 13.0統計軟件。計量資料用表示，兩組各亞間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；哮喘組與對照組比較，采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠ASMCs培養及鑒定結果 在倒置相差顯微鏡下，單個平滑肌細胞呈梭形或不規則三角形，有多個細胞突起，胞質豐富，密度高，核圓形居中。細胞密度低時常交織成網狀，密度高時排列為旋渦狀或柵欄狀。α-Actin免疫細胞化學染色后，胞質內細肌絲沿長軸分布，呈陽性反應，鑒定培養的細胞為ASMCs，見圖1（插頁）。

2.2 α-Actin在ASMCs中的表達 α-Actin經熒光染色后，在熒光顯微鏡下呈綠色熒光。對照組熒光在胞質均勻分布；哮喘組細胞體積增大，細胞核亦有所增大。其中哮喘空白組熒光強度弱于對照空白組，哮喘空白組、哮喘誘導組熒光強度弱于哮喘干預A、B組，見圖2（插頁）。

2.3 FPTⅢ對ASMsC分泌IL-6及Rantes的影響 與對照空白組比較，對照其他各組大鼠ASMCs分泌IL-6水平變化均不明顯（均P＞0.05）。與對照空白組比較，哮喘空白組大鼠ASMCs分泌IL-6水平明顯增加（P＜0.05）；哮喘誘導組變化不明顯（P＞0.05）。與哮喘空白組比較，哮喘干預A、B組IL-6水平均明顯降低（均P＜0.05）。

與對照空白組比較，對照誘導組大鼠ASMC分泌Rantes水平明顯增加（P＜0.05），對照PBS組、對照干預A組及B組分泌Rantes水平改變均不明顯（均P＞0.05）。與對照空白組比較，哮喘空白組大鼠ASMCs分泌Rantes水平明顯增加（P＜0.05）；哮喘誘導組改變不明顯（P＞0.05）。與哮喘空白組比較，哮喘干預A、B組Rantes水平均明顯降低（P＜0.05），見表1。

表1 FPTⅢ對ASMCs分泌IL-6及Rantes的影響

2.4 FPTⅢ對ASMCs分泌IL-6的時間、濃度效應 細胞初始同步化后，細胞分泌功能處于基礎狀態；p21Ras抑制劑干預后，哮喘空白組在24h后出現一個分泌高峰；繼而隨著時間增加，IL-6水平不斷下降；即FPTⅢ可以抑制IL-6分泌，呈時間依賴性，見圖3a。FPTⅢ濃度達5～10μM時，抑制作用最大；＞10μM時，IL-6分泌增加，見圖3b。

2.5 FPTⅢ對ASMCs分泌Rantes的時間、濃度效應細胞同步化后，哮喘空白組基礎分泌水平24h達到高峰，繼而出現下降，最后趨向平坦；經p21Ras抑制劑干預后，Rantes水平降低，72h達到最低點，其變化趨勢與IL-6相似，呈時間依賴性，見圖4a。對于哮喘空白組，5μM FPTⅢ的抑制效應最大，見圖4b。

圖3 FPTⅢ對ASMCs分泌IL-6的時間、濃度效應（a：時間效應；b：濃度效應）

圖4 FPTⅢ對ASMCs分泌Rantes的時間、濃度效應（a：時間效應；b：濃度效應）

3 討論

α-Actin是細胞骨架微絲的基本蛋白，在平滑肌細胞中特異性表達，表型轉化的標志蛋白，構成細胞支架、維持細胞基本形狀，參與細胞變形運動、細胞遷移，介導細胞內信號傳遞及參與蛋白質的合成等[7]。本實驗通過免疫組化鑒定、免疫熒光觀察，發現FPTⅢ會影響ASMCs形態改變（細胞骨架蛋白α-Actin的變化）。IL-6是一種具有廣泛生物學活性的細胞因子，是炎性細胞分化的主要調節因子。ASMCs是其產生的重要來源[8]。本實驗發現對照空白組與對照其他各組比較，ASMCs分泌IL-6水平差異均無統計學意義；這表明正常細胞對于炎癥介質刺激及FPTⅢ干預的靈敏度均不高，提示FPTⅢ干預對于正常ASMCs無明顯影響。哮喘大鼠較正常大鼠ASMCs的IL-6基礎分泌水平明顯增加，提示感染等刺激因素作用于機體時，p21Ras的激活參與IL-6異常分泌，啟動補體及C反應蛋白的表達，產生細胞損害，進一步導致炎性反應的加劇[9]，對哮喘氣道重塑平滑肌表型起重要作用[10]。

哮喘誘導組ASMCs分泌的IL-6水平增加，但與哮喘空白組比較差異無統計學意義；推測哮喘組由于ASMCs長期接受炎癥介質刺激已充分活化，在此基礎上即使進一步刺激，細胞分泌功能改變也不明顯，可能是定位于細胞膜的p21Ras已經達到或接近飽和狀態；與哮喘空白組比較，哮喘干預A、B組IL-6水平均明顯降低，提示FPTⅢ干預可抑制哮喘大鼠ASMCs的IL-6分泌。由此，筆者認為FPTⅢ對正常ASMCs合成分泌IL-6影響并不明顯；但在病理狀態下p21Ras已被激活，在此基礎上進行干預，會產生明顯的抑制效果，即對于哮喘ASMCs分泌合成IL-6起到重要的調控作用。此外，本研究觀察了FPTⅢ對ASMCs分泌IL-6及Rantes的時間、濃度效應。當FPTⅢ濃度為10～20μM時，IL-6水平增加，可能由于抑制了Ras途徑，同時激活了其他旁路途徑，當FPTⅢ濃度進一步增加時，IL-6分泌減少，考慮與FPTⅢ細胞毒性有關。目前IL-6基因表達被認為至少有2條信號轉導通路可觸發，一條依賴蛋白激酶C（PKC）途徑，一條依賴腺昔酸環化酶途徑，以上2條途徑均以Ras/MAPK為共同通路[11]。由此，該試驗也證實了Ras/MAPK途徑參與了ASMCs的IL-6分泌。值得注意的是，體外實驗與在體情況存在差異，體內是否也存在類似現象尚需進一步研究。

ASMCs不僅能分泌炎癥介質，也能分泌趨化因子。受激活調節正常T細胞表達和分泌因子（RANTES）是趨化性細胞因子cc亞族成員（CCL5），參與調節機體的免疫應答[12]。該實驗結果顯示，經誘導后，對照空白組分泌Rantes水平明顯增加，表明正常ASMCs可以通過外界炎癥介質的刺激增強分泌合成功能；哮喘空白組較對照空白組分泌Rantes水平明顯增加，說明哮喘ASMCs的分泌功能較正常ASMCs增強，基礎分泌水平更高；FPTⅢ干預后，哮喘空白組分泌Rantes水平明顯減少，提示FPTⅢ干預也會影響哮喘ASMCs的Rantes分泌。通過比較對照PBS組、哮喘PBS組與對照空白組及哮喘空白組的差異，可排除施加外界干預因素所造成的影響。

綜上所述，FPTⅢ對正常大鼠ASMCs分泌IL-6、 Rantes的影響不明顯，而對于哮喘大鼠ASMCs分泌IL-6、Rantes則有抑制作用，可能是哮喘氣道炎癥中調節免疫的重要因素。

[1] Borish L.The immunology of asthma:Asthma phenotypes and their implications for personalized treatment[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2016,117(2):108-114.

[2] Guenther M K,Graab U,Fulda S.Synthetic lethal interaction between PI3K/Akt/mTOR and Ras/MEK/ERK pathway inhibition in rhabdomyosarcoma[J].Cancer Lett,2013,337(2):200-209.

[3] Richard T,Buckner F S,Yokoyama K,et al.Thematic review series: lipid posttranslational modifications.Fighting parasitic disease by blocking protein farnesylation[J].Journalof Lipid Research,2006, 47(2):233-240.

[4] 許淑云,徐永健.支氣管哮喘模型大鼠氣道重建的特征及機制[J].華中科技大學學報(醫學版),2006,35(4):465-468

[5] 高偉良,邱晨,袁慶莉,等.哮喘大鼠模型氣道重構的病理形態學改變[J].廣東醫學,2006,27(2):176-178.

[6] Deng L H,Fairbank N J,Fabry B,et al.Localized mechanical stress induces time-dependent actin cytoskeletal remodeling and stiffening in cultured airway smooth muscle cells[J].Am J PhysiolCellPhysiol,2004,287(2):440-448.

[7] Kühn S,Mannherz H G.Actin:structure,function,dynamics,and interactions with bacterial toxins[J].Curr Top Microbiol Immunol, 2016,16:45.

[8]Charalambos M,Maria B S,Nadia M,et al.TGF-β regulates Nox4,MnSOD and catalase expression,and IL-6 release in airway smooth muscle cells[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2011,300(2):295-304.

[9] Steven P O,Patrick L S,Christy E.Cholangiocyte N-Ras protein mediates lipopolysaccharide-induced interleukin 6 secretion and proliferation[J].J BiolChem,2011,286(35):30352-30360.

[10] Gautam D,Reynold A,Panettieri Jr.Does airway smooth muscle express an inflammatory phenotype in asthma?[J].Br J Pharmacol,2011,163(1):68-80.

[11] Ugo Moens,Sergiy Kostenko,Baldur Sveinbjo rnsson.The role of mitogen-activated protein kinase-activated protein kinases (MAPKAPKs)in inflammation[J].Genes(Basel),2013,4(2): 101-133.

[12] Donatella Aldinucci,Alfonso Colombatti.The inflammatory chemokine CCL5 and cancer progression[J].Mediators Inflamm, 2014,2:292-376.

Effects of FPTⅢ on the secretion of IL-6 and Rantes in airway smooth muscle cells of asthmatic rats

LI Na,QIU Chen,XUN Anying,et al.Department of Respiratory Medicine，Longgang District Central Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518116，China

Airway smooth muscle cells FPTⅢ Asthma

2017-02-15）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.14.2017-288

深圳市龍崗區科技計劃項目（201505143001004）

518116 深圳市龍崗中心醫院呼吸內科（李娜、季樂財、卓宋明）；暨南大學第二臨床醫學院呼吸內科（邱晨）；北京大學深圳醫院內科（荀安營）

李娜，E-mail：lanying5204@sina.com

【 Abstract】 Objective to investigate the effects of FPTIII on the secretion of IL-6 and Rantes in airway smooth muscle cells of asthmatic rats. Methods To establish the rat model of asthma,the enzyme digestion method is adopted to cultivate airway smooth muscle cells,identified by immunohistochemistry and immunofluorescence.After using p21Ras specific inhibitor FPTIII intervention,IL-6 and Rantes were determinated by ELISA.The intracellular distribution of α-Actin was observed by fluorescence microscopy. Results The fluorescence intensity of α-Actin was stained by fluorescence,and the fluorescence intensity of the blank group was weaker than that of the control group.Secretion of IL-6 and Rantes were significantly decreased (P＜0.05)in asthmatic group after using FPTⅢ,and the inhibitory effect was time-dependent.When the concentration of FPTⅢwas up to 5-10 M,the inhibitory effect reached the maximum. Conclusion FPTⅢintervention can make the asthmatic rat airway smooth muscle cells secreting IL-6 and Rantes decreased,accompanied by intracellular α-Actin changes,which further leads to the change of cell phenotypes,provide new ideas for the treatment of asthma.