更年寧質量控制方法的建立研究

石洪超　楊能英　何風雷

[摘要] 目的 建立評價更年寧質量的方法。方法 采用薄層鑒別（TLC）的方法對更年寧中牡丹皮、白芍、丹參進行薄層定性鑒別。采用高效液相色譜法（HPLC）測定更年寧中的特征性成分黃芩苷的含量。選用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，流動相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；檢測波長為280 nm。結果 在TLC色譜圖中可以檢出牡丹皮、白芍、丹參的特征斑點，且各斑點清晰，易于觀察。黃芩苷在92.4～924 ng范圍內進樣量與其峰面積線性關系良好（r=0.9998）。平均加樣回收率為99.79%，RSD為1.33%（n=6）。該方法精密度、重復性和穩定性良好。結論 本文建立的方法可提供更年寧的質量評價方法，該方法穩定、準確、無干擾且簡便。

[關鍵詞]質量控制；更年寧；薄層鑒別；高效液相色譜法

[中圖分類號] R927.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）07（b）-0141-04

[Abstract]Objective To establish the method for the quality control of Gengnian Ning.Methods Moutan Cortex，Paeoniae Radix Alba，Salvia Miltiorrhiza of Gengnian Ning were identified by thin layer chromatography （TLC）.The content of baicalin （characteristic component of Gengnian Ning） was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）.The ZORBAX Eclipse XDB-C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm） was used，the mobile phase was methanol-water-phosphoric acid （47∶53∶0.2）and the detection wavelength was 280 nm.Results Moutan Cortex，Paeoniae Radix Alba，Salvia Miltiorrhiza could be detectable by TLC and the spots were clear for observation.In the range of 92.4-924 ng，baicalin showed a good linear relationship between sample size and its peak area （r=0.9998）.The average recovery was 99.79% with RSD=1.33% （n=6）.The method had good precision，stability and repeatability.Conclusion The established method is simple，accurate，reliable，reproducible and with strong specificity，which can be used for the quality control of Gengnian Ning.

[Key words]Quality control；Gengnian Ning；Thin layer chromatography；High performance liquid chromatography

更年寧由柴胡、黃芩、白芍、墨旱蓮、人參、黨參、郁金、香附（醋炙）、當歸、薄荷、川芎、玄參、茯苓、法半夏、石菖蒲、牡丹皮、陳皮、干姜、白術（麩炒）、丹參、王不留行（炒）、女貞子（酒炙）等22味中藥組成。更年寧處方源于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第六冊（標準編號WS3-B-1138-92），功效為疏肝解郁，益氣養血，健脾安神[1]。現執行的更年寧標準中只有顯微鑒別和墨旱蓮的薄層鑒別，無含量測定項目，內容簡單，難以評價更年寧的內在質量特性。本文通過實驗研究，發現白芍、牡丹皮、丹參的薄層色譜特征性強，斑點清晰，可以列入質量標準，同時增加了高效液相色譜法（HPLC）測定黃芩中黃芩苷的含量測定，以期更好地控制更年寧的質量。

1 儀器與試藥

1.1儀器

高效液相色譜儀型號為Waters 2695；檢測器的型號為Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector；Sartorious（CP225D）十萬分之一天平，Sartorious（BS110S）萬分之一天平。SB-5200DT超聲波清洗機（300 W，40 Hz）。色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號：110736-201426）、丹參酮ⅡA對照品（批號：110766-200416）、黃芩苷對照品（供含量測定用，批號：110715-200212），來源均為中國藥品生物制品檢定所。更年寧（10批水蜜丸）及陰性樣品均由廣州白云山陳李濟藥廠有限公司提供，乙腈為色譜純；水為Millipore 去離子水；磷酸、乙醇、甲苯、乙酸乙酯和三氯甲烷等試劑均為AR。

2方法與結果

2.1丹參的薄層鑒別試驗

更年寧樣品供試液的制備：取更年寧樣品適量，粉碎成細粉，取約10 g， 加三氯甲烷70 ml，超聲30 min，過濾，蒸干溶劑，用1.5 ml乙醇將殘渣溶解，即得[2-3]。

丹參酮ⅡA對照品供試液的制備：取丹參酮ⅡA對照品約2.5 mg，置5 ml的容量瓶中，加入乙醇溶解，用乙醇稀釋至刻度，即得。

丹參陰性對照溶液的制備：按更年寧的制備工藝，去掉丹參藥材，制成缺丹參的陰性樣品。取該樣品適量，粉碎成細粉，按上述更年寧樣品供試液的制備方法制備，即得。

檢測方法：照薄層色譜方法試驗，吸取更年寧樣品供試液、丹參酮ⅡA對照品供試液、丹參陰性對照溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯 （19∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，日光下觀察薄層色譜特征斑點，見圖1。

實驗結論：更年寧樣品色譜中，在與對照品丹參酮ⅡA色譜相對應的地方，都有暗紅色的斑點，斑點清晰，在丹參陰性對照色譜中未見，因此丹參陰性對照無干擾，可以列入質量標準。

2.2牡丹皮、白芍的薄層鑒別試驗

更年寧樣品供試液的制備：取更年寧樣品適量，粉碎成細粉，取約5.0 g，加入40 ml甲醇，超聲提取40 min，過濾，蒸干溶劑，用5 ml甲醇將殘渣溶解，即得[4]。

芍藥苷對照品供試液的制備：取芍藥苷對照品約5 mg，置5 ml的容量瓶中，加入乙醇溶解，用乙醇稀釋至刻度，即得。

雙陰性（牡丹皮、白芍） 供試液的制備：按更年寧的制備工藝，去掉牡丹皮、白芍2味藥材，制成它們的雙陰性樣品。取該樣品適量，粉碎成細粉，按上述更年寧樣品供試液的制備方法制備，即得。

檢測方法：照薄層色譜方法試驗，吸取更年寧樣品供試液、芍藥苷對照品供試液、雙陰性（牡丹皮、白芍） 供試液各3 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。見圖2。

實驗結論：更年寧樣品色譜中，在與對照品芍藥苷色譜相對應的地方，都有藍色的斑點，斑點清晰，在雙陰性（牡丹皮、白芍）色譜中未見。因此牡丹皮、白芍的雙陰性無干擾，可以列入質量標準，對本產品的質量控制有一定的意義。

2.3黃芩苷的含量測定方法及方法學考察

2.3.1 含量測定方法

更年寧樣品供試液制備：取本品適量，粉碎成細粉，取約0.35 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入50 ml 70%乙醇，密塞，精密稱定，超聲提取（超聲頻率為40 kHz，超聲功率為250 W）30 min，放冷，再次稱定重量，以70%乙醇補足重量，用微孔濾膜過濾，取續濾液，即得[5]。

黃芩苷對照品溶液制備：精密稱取黃芩苷對照品（60℃減壓干燥4 h）4 mg，置100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每毫升含黃芩苷40 μg的對照品溶液。

色譜條件：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；檢測波長為280 nm；柱溫為30℃；流速為1 ml/min；理論塔板數以黃芩苷峰計≥3000。

測定方法：分別精密吸取黃芩苷對照品溶液與更年寧樣品供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3.2 方法學考察

2.3.2.1 專屬性 按更年寧的制備工藝，去掉黃芩藥材，制成黃芩的陰性樣品。取該樣品適量，粉碎成細粉，按“2.3.1”項下含量測定方法項下更年寧樣品供試液制備方法制備黃芩陰性對照溶液，分別吸取黃芩苷對照品溶液、更年寧樣品供試液、黃芩陰性對照溶液各10 μl，依法測定。更年寧樣品色譜圖中，在與黃芩苷對照品色譜相對應的位置上，有相同保留時間的色譜峰，而黃芩陰性對照品色譜無干擾，表明本法有專屬性，可以作為含量測定指標，見圖3。

2.3.2.2 線性關系考察 分別精密吸取黃芩苷對照品母液（0.0924 mg/ml）1、2、4、6、8、10 ml于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度為9.24、18.48、36.96、55.44、73.92、92.4 ng/μl的對照品溶液，分別吸取10 μl注入液相色譜儀，平行進樣各兩次，以兩次峰面積平均值為縱坐標、黃芩苷進樣量（ng）為橫坐標，繪制黃芩苷標準曲線，其線性回歸方程為：Y=3442.8X-35 951（r=0.9998）。結果表明黃芩苷進樣量在92.4～924 ng范圍內，峰面積與進樣量之間的線性關系良好。

2.3.2.3 精密度試驗 取同一批更年寧樣品（批號：2014 1001），按“2.3.1”項下含量測定方法項下更年寧樣品供試液制備方法制備供試液，依次進樣6次，依法測定。經測定供試液中的黃芩苷色譜峰面積的標準偏差（RSD）為0.31%，顯示該液相色譜具良好的精密度。

2.3.2.4 重復性試驗 取更年寧樣品（批號：20141001）6份，每份精密稱取0.35 g，按“2.3.1”項下含量測定方法項下更年寧樣品供試液制備方法制備供試液，依法測定，黃芩苷的含量為3.91 mg/g，RSD為0.22%（n=6），結果顯示該方法重復性良好。

2.3.2.5 穩定性 取更年寧樣品（批號：20141001），按“2.3.1”項下含量測定方法項下更年寧樣品供試液制備方法制備供試液，依次在0、2、4、6、8、12 h進樣，依法測定，測得黃芩苷的平均峰面積為875481.5，RSD為0.25%（n=6）。結果顯示供試液在12 h內具有良好的穩定性。

2.3.2.6 準確度（回收率試驗） 取更年寧樣品（批號：20141001）6份，每份約0.18 g，精密稱定，依次分別每份添加黃芩苷對照品溶液（0.3776 mg/ml）2 ml，按“2.3.1”項下含量測定方法項下更年寧樣品供試液制備方法制備供試液，依法測定，依測得數據計算樣品回收率，結果見表1。黃芩苷的平均回收率為99.79%，RSD為1.33%（n=6）。

2.3.2.7 樣品含量測定 取更年寧樣品10批，按“2.3.1”項下含量測定方法項下更年寧樣品供試液制備方法制備供試液，依法測定，按測得數據計算供試液中的黃芩苷含量，結果見表2。

3討論

在薄層鑒別試驗中，白芍的薄層鑒別特征斑點主要是芍藥苷，對處方中白芍的薄層鑒別進行研究，發現樣品中陰性有干擾，經查閱文獻資料，處方中白芍和牡丹皮均含有芍藥苷，因此，建立了白芍和牡丹皮雙陰性的薄層鑒別方法；對處方中的川芎、當歸的薄層鑒別進行了研究，分別對川芎、當歸的薄層做了比較試驗，川芎和當歸的單陰性樣品有干擾，考慮到川芎和當歸本身色譜特征很相似，經常作為雙陰性的形式出現，同時考察了缺川芎和當歸兩味藥材雙陰性的干擾情況，進一步實驗發現更年寧中當歸、川芎的雙陰性也有干擾[6]；對處方中玄參、干姜、白術、香附、王不留行、郁金和陳皮的薄層鑒別進行了研究，但樣品和陰性的色譜特征斑點相似度很高，基本沒有區別，表明陰性對照試驗有干擾[7-13]；對處方中人參、薄荷、石菖蒲、黨參、柴胡和法半夏的薄層鑒別進行了研究，但樣品和對照藥材的色譜斑點顏色有差異，且Rf值也有偏移，可能由于該處方成分復雜，其它成分干擾影響其斑點的顯色和成分的展開[14-19]。

在含量測定研究中，本品處方由22味中藥組成，白芍中有效活性成分芍藥苷、牡丹皮中有效活性成分丹皮酚，但芍藥苷和丹皮酚的陰性有干擾，專屬性不好，因此，正文中選擇了黃芩作為含量測定對象，以其有效活性成分黃芩苷作為指標成分，建立了黃芩苷的含量測定（高效液相色譜法）。分析方法驗證結果表明該測定方法專屬、結果準確、重復性好。對樣品的提取方法進行了考察，超聲提取45 min和回流提取3 h的提取效率接近，考慮到操作的簡單、方便，選擇超聲提取。在此基礎上，對超聲時間（30、45、60 min）進行了比較，超聲30 min后，樣品溶液中的黃芩苷的含量不再增加，說明30 min超聲已經完全，故確定樣品的超聲時間為30 min。

[參考文獻]

[1]衛生部藥典委員會.衛生部藥品標準中藥成方制劑（WS3 -B-1138-92）[Z].第六冊，1992：70.

[2]童志遠，陳燕，馬才敬，等.腦血通片顯微及薄層鑒別方法研究[J].西南軍醫，2016，18（5）：420-422.

[3]伍曉群，李躍輝.丹黃通絡丸質量標準研究的研究[J].湖南中醫雜志，2016，32（9）：171-173.

[4]曹文利，曹秀蓮，王曉亞，等.白芍配方顆粒質量標準的提高研究[J].河北中醫藥學報，2016，31（3）：46-48.

[5]潘楣. HPLC法測定復方黃芩片中黃芩苷的含量[J].廣東藥學院學報，2014，21（6）：689-690.

[6]朱冬可，吳佩穎，高崎，等.乳腺消郁顆粒的質量控制[J].中成藥，2015，37（6）：1375-1379.

[7]郝博，蘇建.益膽片質量標準完善研究[J].中國藥事，2014， 28（7）：778-782.

[8]張紅，孫婷婷，衛向峰，等.參茸健腦膠囊質量標準研究[J].陜西中醫，2016，37（9）：1243-1244.

[9]孫露萍，王菊濤.胃炎康顆粒的質量標準研究[J].時珍國醫國藥，2015，26（4）：891-893.

[10]盧君蓉，李文兵，傅超美，等.香附藥材的質量控制方法的探討[J].中國醫院藥學雜志，2015，35（5）：389-392.

[11]趙建穎，盧曉梅，李亮亮，等.復方王不留行片的質量標準研究[J].中國藥房，2015，26（24）：3426-3428.

[12]崔曉敏，李芳，李凡，等.雙參膠囊的質量標準提高研究[J].中國藥房，2016，27（2）：1677-1679.

[13]童曉東，陳志軍，楊水英，等.益視明目顆粒的質量標準研究[J].現代中藥研究與實踐，2016，30（1）：42-45.

[14]廖格斯，汪宇，于世龍，等.和胃顆粒質量標準研究[J].實用藥物與臨床，2016，19（12）：1520-1530.

[15]李勇，沈雪梅，陳慧明，等.銀連感冒茶的質量標準研究[J].中國藥業，2013，22（19）：31-33.

[16]李養學，曾文雪，陳秋谷，等.遠芪口服液質量標準研究[J].江西中醫藥，2016，47（12）：60-63.

[17]刁娟娟，李小玲，李新霞，等.益膚丸的薄層色譜鑒別[J].中國現代中藥，2016，18（10）：1335-1340.

[18]嚴華，董亞娟，程顯隆，等.南柴胡與常見混偽品的鑒別方法研究[J].中國藥學雜志，2015，50（2）：109-114.

[19]梁學政，唐勇琛，甄漢深，等.溫衛陽膠囊的質量標準研究[J].海峽藥學，2015，27（10）：57-60.

（收稿日期：2017-06-28 本文編輯：許俊琴）