基于細胞自噬探討補腎中藥復方防治動脈粥樣硬化的研究思路

曹慧　申定珠　陳川

[摘要] 動脈粥樣硬化（AS）是一種隨年齡不斷增長、以中老年人為主要發病人群的自身免疫性疾病。自噬是由溶酶體介導的降解細胞內受損細胞器或蛋白質的代謝過程。基于免疫介導的細胞自噬在AS形成、發展中的重要作用以及補腎中藥復方有效干預治療AS的前期研究結果，現擬從細胞自噬角度深入探討補腎中藥復方通過細胞自噬途徑干預AS的研究策略。

[關鍵詞] 動脈粥樣硬化；衰老；免疫；自噬；補腎中藥復方

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（a）-0077-04

[Abstract] Atherosclerosis （AS） is an autoimmune disease that grows with age and is predominantly in the elderly. Autophagy is a lysosomal-mediated process for the degradation of intracellularly damaged organelles or proteins. Based on the important role of immune-mediated autophagy in the AS formation and development and the effect of compound Chinese Medicine for reinforcing kidney on intervention of AS. This paper intends to explore the research strategy of compound Chinese Medicine for reinforcing kidney by interfering with AS by autophagy pathway.

[Key words] Atherosclerosis； Aging； Immune； Autophagy； Compound Chinese medicine for reinforcing kidney

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是由多因素共同作用的復雜性疾病，具有炎性反應的自身免疫因素在其中發揮重要作用[1]。自噬是細胞在自噬相關基因（autophagy associated gene，ATG）的調控下利用溶酶體降解細胞內受損細胞器以及大分子物質的代謝過程。新近有研究表明，細胞自噬在AS的發生、發展中扮演重要角色，適度的自噬對AS具有保護作用，而過度的自噬可導致細胞死亡，不利于斑塊的穩定性[2]。前期研究證實，補腎法是針對AS行之有效的中醫治則[3]，補腎中藥復方可有效干預治療AS[4-5]。基于此，本文將深入探討基于細胞自噬層面的補腎中藥復方抗AS的研究思路，為補腎中藥復方有效防治AS提供新的策略和治療靶點。

1 AS是與增齡、衰老過程密切相關的自身免疫性疾病

1.1 AS是與增齡相關的退行性疾病

AS的發病機制至今尚未完全闡明，諸多學者先后提出脂質浸潤、炎癥、免疫、血栓形成等多種假說。AS多發于中老年人群，提示其在本質上是一種與增齡、衰老過程密切相關的退行性病變。既往有觀察性隊列研究通過對312名觀察者進行心臟和胸主動脈MRI成像檢測，發現AS性主動脈壁負荷與高血壓、糖尿病、吸煙或膽固醇水平等諸多傳統因素無關，卻與年齡增長顯著相關，從而提示AS與增齡、衰老進程的密切相關性[6]。作為AS危險因素與亞臨床檢測金指標的頸動脈內膜-中膜厚度（intima-media thickness，IMT），亦表現出與年齡的高度相關性，進一步證實AS與增齡、衰老過程密切相關[7]。

1.2 應重視免疫因素在AS病理過程中的作用

AS是具有炎性反應的自身免疫性疾病，其發生、發展過程中始終伴有免疫細胞的浸潤。單核巨噬細胞、適應性免疫中的T細胞和B細胞以及細胞因子均參與了該過程。人類外周單核細胞根據其表達的白細胞分化抗原可分為CD14+CD16-細胞與CD14+CD16+細胞。在脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）刺激下，CD14+CD16+細胞可產生具有致炎作用的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），是目前公認的AS危險因素之一[8]。在巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）和其他分化因子的驅動下，處于早期AS病變區的單核細胞可轉變為巨噬細胞，具體表現為具有促炎作用的M1型細胞和具有抗炎修復作用的M2型細胞[9]。早期AS斑塊中的浸潤細胞以M2型巨噬細胞為主，具有良好的胞葬作用，可保護周圍組織免受凋亡細胞內部有毒物質的損害，從而維持斑塊的穩定性[10-11]。若AS病變進一步發展，則M1型巨噬細胞逐漸占據主導地位，產生與經典活化相關的細胞因子，分泌金屬蛋白酶降解膠原纖維，導致斑塊纖維帽變薄、易損系數增加，進而加快AS進程[11-13]。CD4+Th細胞廣泛存在于AS斑塊中，在oxLDL和LDL刺激下，Th1可分泌IFN-γ，導致內皮功能受損及炎癥細胞的募集，從而促進AS的病變發展。Th2細胞因子則可有效抑制Th1分化以及IFN-γ的分泌，可能在AS進程中起到保護作用[14]。由此可見，作為免疫系統重要成員的單核細胞、巨噬細胞以及T淋巴細胞，在AS的發生、發展過程中均發揮了至關重要的作用。

2 免疫介導的細胞自噬在AS形成、發展中的重要作用

2.1 自噬及相關機制

在哺乳動物中，細胞自噬的類型現已基本明確。根據吞噬物進入溶酶體的途徑不一，可分為微自噬、巨自噬以及分子伴侶介導的自噬。自噬相關基因（autophagy-associated gene，ATG）編碼的蛋白ATG5-ATG12復合物、Beclin 1以及微管相關蛋白LC3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）Ⅱ均參與了自噬體的形成。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）與Atg/ULK復合體分離，ULK1磷酸化Beclin 1，Beclin 1/Class Ⅲ PI3K/Vps15/Atg14復合物形成并進一步促進自噬體成核、延伸[15]。自噬體膜的延伸主要受兩種泛素樣蛋白系統調節，第一條泛素樣蛋白加工過程由Atg12介導，通過E1泛素激活酶Atg7、E2樣泛素結合酶Atg10與泛素樣蛋白Atg5結合，形成Atg12-Atg5復合物，隨后Atg16L與Atg12-Atg5結合形成一個大的多聚體。第二條泛素樣蛋白過程由Atg8介導，其哺乳動物中的LC3被Atg4水解為活化的胞質可溶性的LC3-Ⅰ，隨后Atg7催化E2泛素結合酶Atg3促進LC3-1與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-Ⅱ。一旦自噬體形成后，Atg12-Atg5-Atg16L復合物從該結構解離，Atg4將外部脂質雙層上的Atg8釋放到細胞質中，自噬體與溶酶體結合。

2.2 免疫介導的細胞自噬與AS的相關性

細胞自噬在AS發生、發展中具有重要作用，其可降解細胞內受損結構，保護斑塊細胞免受炎癥和氧化應激損傷，減少內皮細胞（endothelial cells，ECs）的凋亡與壞死，抑制斑塊發展[16]。作為纖維帽中唯一產生間質膠原纖維的細胞，平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）的自噬可能是維持斑塊穩定性的重要因素[17]。自噬還能調節巨噬細胞的極化性，使促炎的M1型向抑炎的M2型轉化，從而促進炎癥轉歸[18]。自噬作為體內重要的降解途徑，參與了巨噬細胞的脂質代謝，可促進泡沫細胞內膽固醇外流，該過程阻斷會增加斑塊內脂質的累積，提示自噬對AS具有保護作用[19]。與基礎水平的自噬不同，過度的自噬則會導致細胞器和蛋白質的破壞，往往引起細胞死亡[20]。ECs的過度自噬可促進血栓形成，引起冠狀動脈綜合癥等急性臨床事件的發生，而SMCs的自噬性死亡意味著膠原合成減少和斑塊纖維帽變薄，促進斑塊往不穩定方向發展[21]。因此，對于細胞自噬的調控在AS防治中的重要性可見一斑。自噬參與了細胞內的多種生理活動，在淋巴細胞發育、固有免疫和適應性免疫應答的調控中均發揮重大作用[22]。機體的免疫應答能夠特異性的調節自身免疫機制、增強細胞自噬活動，殺滅體內的病原體與微生物，保護細胞免于損傷，從而維持內環境的穩態。既往有研究顯示，病原體感染與AS等心血管疾病密切相關，肺炎衣原體感染可誘導氧化應激反應，促進血管炎性反應，在AS形成、發展過程中發揮重要作用[23]。CD40分子可作為自噬相關基因Beclin 1的調控因子，可致Beclin 1高表達與細胞自噬的增強，并通過CD40-p21-Beclin 1通路介導進一步殺滅胞內病原體[24]。因此，適應性免疫可能通過增強自噬以殺滅病原體，減輕AS進程中的炎性反應。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）作為天然免疫系統識別病原微生物的主要受體，在天然免疫和獲得性免疫中起到橋梁作用，其中TLR7配體可通過增強MyD88與Beclin 1的相互作用，誘導基礎水平的自噬，減少斑塊中巨噬細胞數量，降低促炎因子的釋放，從而達到穩定粥樣斑塊的作用[25]。綜上可知，獲得性免疫與先天性免疫均可通過調節細胞自噬，進而參與了AS的發生、發展。

3 基于細胞自噬的補腎中藥復方防治As的策略

3.1 AS中醫機制闡釋以及補腎中藥復方于AS防治中的研究前景

AS的西醫病理機制研究目前主要集中于脂質浸潤、炎性反應、免疫損傷、氧化應激等方面。中醫認為AS的病機多本虛標實，腎虛致AS一直受到諸多學者的重視。腎主藏精，為先天之本。人至高年，腎元虧虛、腎氣不足，結合多發于高年之人的AS是一與衰老進程密切相關的自身免疫性疾病的基本觀點，故提出隨年齡增長所誘發的自身免疫功能的進一步下降往往會導致AS的發生、發展。相關動物實驗和臨床研究均表明，補腎中藥復方能夠多環節、多靶點、多途徑發揮抗AS作用，且不良反應少，其機制與抗氧化應激、調節脂質代謝、抑制血管平滑肌增殖、抗炎、穩定AS斑塊等有關，揭示了補腎中藥復方在AS防治中的重要性[26]。

3.2 課題組前期研究成果

自20世紀80年代以來，課題組基于AS是一與衰老密切相關的退行性疾病的基本認識，前期AS模型兔的實驗研究結果表明，補腎中藥復方在延緩衰老的同時表現出明顯的抗AS作用。無論從組織病理形態方面，還是調節脂質代謝、保護血管內皮、清除自由基等方面，補腎中藥復方均具有顯著療效[27]。進一步的動物實驗提示，補腎中藥復方對AS模型大鼠的整體狀況、主動脈組織學均有顯著的干預治療作用，可通過降低血脂對血管內皮的損傷、減輕局部炎性反應、抗氧化應激損傷，延緩血管老化，進而抑制AS的發生、發展[28]。補腎中藥復方還可下調ApoE-/-小鼠主動脈TLR4蛋白表達水平及血清MCP-1、ICAM-1水平進而有效干預治療AS[29]。課題組后續深入的臨床試驗研究結果表明，補腎中藥復方可降低頸動脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis，CAS）患者血漿TC、LDL-C含量，降低白細胞介素-6（Interleukin 6，IL-6）、C反應蛋白（C reactive protein，CRP）表達[4-5]；降低CAS患者臂踝脈搏波傳導速度（brachial-ankle pulse wave velocity，baPWV）及頸動脈內中膜厚度（carotid intima media thickness，CIMT），增加CAS患者頸動脈血管彈性[30]。上述課題組前期研究結果揭示了補腎中藥復方可有效干預治療AS，彰顯了補腎中藥復方在AS防治中的應用前景，但相關機制尚需進一步闡明。

3.3 從細胞自噬角度探討補腎中藥復方防治AS的可行性

腎主骨生髓、藏精，乃先天之本。現代醫學證實，參與免疫反應的主要活性細胞均源于骨髓的多能造血干細胞，故腎與免疫有著密切的關系。腎虛衰老可導致免疫系統紊亂，補腎中藥復方具有調節免疫功能及抗衰老作用[31]。細胞自噬可視為氣化功能的微觀體現，機體可通過“精化氣”形式以維持正常生命活動，促進內生邪實的清除，以此達到陰陽平衡。一旦“精氣轉化”的氣化功能停止，必將導致陰陽離絕。因此，自噬可認為是正氣虧虛下的自救方式，而補腎法可增強細胞自噬不足狀態下的自噬功能[32]。基于AS是一與衰老有關的自身免疫性疾病的基本認識，認為腎虛致免疫功能紊亂、自噬功能減退是AS的發病機制之一，補腎中藥復方可能通過調控細胞的自噬不足、增強機體免疫功能的平衡狀態進而實現對AS的有效干預。因此，課題組將緊密聯系前期補腎中藥復方有效干預治療AS的研究結果，以細胞自噬在AS研究中的最新進展為依托，采用規范、系統的體內、體外實驗方案，結合AS形成過程中與自噬密切相關的ATG5、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62等生物標志物以及相關通路的關鍵靶點，以期深入評估補腎中藥復方通過自噬途徑有效干預治療AS的作用機制。

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（收稿日期：2017-04-04 本文編輯：李岳澤）