電化學發光免疫分析在免疫檢驗中的應用及結果影響因素研究

王玉霞

(開封第二中醫院檢驗科，河南開封475004)

電化學發光免疫分析在免疫檢驗中的應用及結果影響因素研究

王玉霞

(開封第二中醫院檢驗科，河南開封475004)

目的研究電化學發光免疫分析在免疫檢驗中的應用情況，并分析其結果的主要影響因素。方法對電極形狀對電化學發光影響情況進行了研究和分析，比較了不同形狀的電極的發光效率。結果四孔電極電化學發光強度較圓片電極提升約50%至90%，采用圓片電極檢測Ru(bpy)3Cl2.6H2O極限值為1fmol/L，采用四孔圓片電極極限為1amol/L可見通過提高比表面積可實現發光效率的增加。結論電化學發光免疫分析是一種方便、快捷且靈敏度較高的免疫檢驗方法，電極形狀對電化學發光效率具有較大影響，電化學發光主要集中在邊緣位置，調整比表面積可實現檢測范圍動態可調整。

電化學發光；免疫檢驗；電化學發光效率；影響因素

電化學發光免疫分析(electrochemiuminescence immunoassay，ECLIA)是免疫檢測和光化學發光結合的新型免疫分析方法[1]，與常規化學發光不同，電化學發光免疫分析的標記物為電極表面的特異性化學發光反應[2]，由電化學和化學發光兩個部分組成[3]。與其他免疫分析法比較，電化學發光免疫分析具有靈敏度高、檢驗范圍廣、檢驗速度快、無任何發射性等多種優點[4]，在自動免疫分析前沿技術中，以其較好的操控性和極強穩定性的優勢在生命科學研究中表現出了較好的發展前景[5，6]。為研究電化學發光免疫分析在免疫檢驗中的應用及結果影響因素情況，設計了圓片、四孔、螺旋絲狀三種形態電極，對其電化學發光圖像及發光強度進行了檢測，現將相關情況報告如下。

1 資料與方法

1.1 試劑及儀器試驗選擇美國Sigma-Aldrich公司生產的六水合二氯三聯吡啶釕、Sigma公司生產的三丙胺、鄭州市統麒化工產品有限公司生產的硫酸鉀等常用試劑。二維成像系統由ICCD、ST-130控制器、恒溫水泵、PC機組成。由ST-130控制器制冷零下40℃后，放入暗箱，通過光學透鏡在ICCD光電陰極成像[7]，由ST-130控制器進行數據采集和傳送，通過winview對圖像進行處理。

1.2 電極選擇本次實驗使用的三種電極均為定做電極，圓片電極直徑為1.5cm，四孔電極通過對圓片電極鉆直徑1mm的小孔獲得，螺旋絲電極通過鉑絲彎曲制作。

1.3 實驗方法將六水合二氯三聯吡啶釕溶解到0.1mol/L的硫酸鉀中，配制成1mmol/L母液，實際應用時采用磷酸鹽稀釋到相應濃度，將六水合二氯三聯吡啶釕和三丙胺按照2：1比例加入樣品池，兩級電壓為1.25V，采用ICCD成像，并對發光強度進行探測。

1.4 統計學處理對統計數據采用SPSS 17.0進行分析，計量采用均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05視為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 電化學發光影像圓片電極和四孔電極均有邊緣發光現象，四孔電極除四孔發光外，小孔也有發光現象，100mol/L六水合二氯三聯吡啶釕與三丙胺圖形清晰，信噪比為4，螺旋狀電極發光為螺旋狀。

2.2 發光強度比較使用濃度從1amo/lL到1nmo/ lL的六水合二氯三聯吡啶釕和三丙胺，分別測試圓片和四孔電極的發光體系的ECL強度，測試結果如表1。

表1可見，四孔電極電化學發光強度較圓片電極提升約為50%至90%的，采用圓片電極檢測Ru(bpy)3Cl2.6H2O極限值為1fmol/L，采用四孔圓片電極極限為1amol/L，可見通過提高比表面積可實現發光效率的增加。

3 討論

抗原-抗體特異性結合是當前免疫學最關心的核心問題，而電化學發光免疫分析恰恰是較好的利用這種生物特異性實現了對復雜生物體系的分析選擇[8，9]。

在現有電化學發光技術中，廣泛采用的工作電極都是表面光滑的圓片狀電極[10，11]。所以根據“邊緣效應”，電荷在電極表面分布不均，使得發光主要集中在工作電極的邊緣，而電極中間的部分區倒職寸發光來說幾乎是無效的，這導致了發光效率低，探測靈敏度低，使得探測極限只育影左到皮摩爾或納摩爾量級[12，13]。有研究者[14，15]采用電化學發光免疫分析對人絨毛膜促性腺激素、前列腺特異性抗原、游離甲狀腺素的測定情況。有研究者采用電化學發光免疫分析證實了黃疸和溶血對測試結果無影響。有研究者[18]利用電化學發光免疫分析對前列腺特異性抗原測試情況應用于前列腺患者臨床診斷分析，使電化學發光免疫分析蛋白質及激素分析應用到了臨床當中。有研究者[19]對電化學發光免疫分析進行條件優化后，實現了高靈敏度細菌濃度測定，完成了鼠疫抗原、沙門菌、O-157病毒的食品環境測定，為電化學發光免疫分析在食品環境中的應用開辟了道路[12]。有研究者對黑素瘤中酪氨酸脫脂核糖核酸進行擴增后，采用電化學發光免疫分析對其產物進行定量分析，將電化學發光免疫分析應用到了核酸雜交分析當中[20]。

表1 圓片和四孔電極上的電化學發光強度比較情況

作為一種前沿免疫標記技術，電化學發光免疫分析給臨床診斷及生命科學研究提供了一種有效的非同位素檢測手段，已經成為免疫分析和DNA分析的前沿方法，相關理論研究及芯片開發工作均取得了長足發展[21]。本研究以電化學發光免疫分析中應用及結果影響因素為切入點，通過不同形狀電極對其發光情況的研究分析，發現圓片電極和四孔電極均有邊緣發光現象，四孔電極除四孔發光外，小孔也有發光現象，100mol/L六水合二氯三聯吡啶釕與三丙胺圖形清晰，信噪比為4，螺旋狀電極發光為螺旋狀。四孔電極電化學發光強度較圓片電極提升約為50%~90%，采用圓片電極檢測Ru(bpy)3Cl2.6H2O極限值為1fmolL/，采用四孔圓片電極極限為1amo/lL，考慮如果使用篩網狀電極可達1μmolL/。我們認為通過提高比表面積可實現發光效率的增加。

總之，電化學發光免疫分析是一種方便、快捷且靈敏度較高的免疫檢驗方法[18，19]，電極形狀對電化學發光效率具有較大影響[20，21]，電化學發光主要集中在邊緣位置，調整比表面積可實現檢測范圍動態可調整。

[1]Chang KP，Hao SP，Lin SY，et al.A lack of acssoiation between P53 mutiatosn and recurrent nasopharyngeal carcinomas refractoy to radiotherapy[J].Laryngoscope，2002，112(11)：2015-2019.

[2]Zhao F，Zhou QH，Zang LL.Per-and post-operative sequential changes of serum P53 antibodies and clinical significance in patients with lung cancer[J].Clin J Lung cancer，2003(4)：253-256.

[3]常建華，董綺功.波譜原理及解析[M].北京：科學出版社，2001：110-111.

[4]Ren S，Wang X，Tang B，et al.Micro-plate chemiluminescence enzyme immunoassay for clinical determination of progesterone in human serum[J].Chin J Anal Chem，2008，36(6)：729-734.

[5]Xiao Q，Li H，Hu G，et al.Development of a rapid and sensitive magnetic chemiluminescent enzyme immunoassay for detection of luteinizing hormone in human serum[J].Clin Biochem，2009，42：1461-1467.

[6]Wang X，Ying X，Lin JM，et al.Evaluation of carbohydrate antigen 50(CA 50)in human serum using magnetic particle-based chemiluminescenceenzymeimmunoassay[J].AnalChimActa，2007，598：261-267.

[7]Lu CD，Altieri DC，Tanigawa N.Expression of a novel antiapoptosis gene，survivin，correlated with tumor cell apoptosis and p53 accumulation in gastric carcinomas[J].Cancer Res，1998，58(9)：1808-1812.

[8]王栩，林金明.化學發光免疫分析技術新進展[J].分析實驗室，2007，26（6）：111-122.

[9]Schlichtholz B，Tredaniel J，Lubin R，et al.AAnalyses of p53 antibodies in sera of patients with lung carcinoma define immunodominant regions in the p53 protein[J].Br J Cancer，1994，69(5)：809-816.

[10]Zhao F，Zhou QH，Zhang L.Pre-and post-operative sequential changes of serum p53 antibodies and clinical significance in patients with lung cancer[J].Clin J Lung Cancer，2000，3(4)：253-256.

[11]Xie Y，Yao KT，Hu WX.Mutation and expression of p53 gene in nasopharyngeal carcinoma，cervecal carcinoma and lung cancer[J]. Clin J Pathol，1997，26(4)：229-232.

[12]Yu H，Bruno JG.Immunomagnetic-elech-ochemiluminescent detection of Escherichia coli 0157 and Salmonella typhimurium in foods and environmental water samples[J].Appl Environ Microbiol，1996，62(2)：587-592.

[13]閏貴虹，邢達，譚石慈.穿孔電極對電化學發光惻夏的影響[J].應用化學，2003，20(5)：493-495.

[14]Wang J，Liu GD，Engelhard MH，et al.Sensitive Immunoassay of a Biomarker Tumor Necrosis Factor-α Based on Poly(guanine)-Functionalized Silica Nanoparticle Label[J].Anal Chem，2006，78：6974-6979.

[15]Yin ZZ，Liu Y，Jiang LP，et al.Electrochemical immunosensor of tumor necrosis factorα based on alkaline phosphatase functionalized nanospheres[J].Biosens Bioelectron，2011，26：1890-1894.

[16]Liang R，Peng H，Qiu J.Fabr ication，characterization，and application of potentiometric immuno sensor based on biocom patible and controllable three dimensional porous chitosan membranes[J]. J Colloid Interface Sci，2008，320(1)：125-131.

[17]Rezaei B，Khayamian T，Majidi N，et al.Immobilization of specific monoclonal antibody on Au nanoparticles for h GH detection by elect rochemical impedance spect roscopy[J].Biosens Bioelectron，2009，25(2)：395-399.

[18]Yang GJ，Huang JL，Meng WJ，et al.A reusable capacitive immunosensor for detection of Salmonella spp.Based on grafted ethylene diamine and self-assembled gold nanoparticle monolayers [J].Anal Chim Acta，2009，647(2)：159-166.

[19]Narambuena CF，Del Popolo MG，Leiva EPM.On the Reasons for Stepwise Changesinthe Tunneling CurrentacrossMetallic Nanogaps[J].Nano Letters，2003，3(12)：1633-1637.

[20]Katz WE.Integration of Layered Redox Proteins and Conductive Supports for Bioelectronic Applications[J].Angew Chem In Ed，2000，39：1181-1218.

[21]Lee SB，Mitchell DT，Trofin L，et al.Antibody-Based Bio-Nanotube Membranes for.

R446.62

A

1674-1129(2017)04-0516-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.020

2016-10-24；

2017-06-01)