維格列汀原料藥有關(guān)物質(zhì)測定方法的研究

黃艷　楊雪峰　陳雪云

[摘要] 目的 建立高效液相色譜法測定維格列汀原料藥的有關(guān)物質(zhì)。 方法 采用Waters XTerra MS C18柱（4.6mm×50mm，3.5μm），以磷酸鹽緩沖液-水-乙腈-甲醇（80：120：3：3）為流動相A，以磷酸鹽緩沖液-乙腈-甲醇（8：9：3）為流動相B，梯度洗脫，檢測波長為210nm；流速1.5mL/min。 結(jié)果 維格列汀與相鄰雜質(zhì)峰以及各雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1.3，檢測限為1.2～1.6ng，定量限為2.4～3.3ng。 結(jié)論 該方法適用于維格列汀關(guān)物質(zhì)的測定。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜法；維格列汀；有關(guān)物質(zhì)；測定

[中圖分類號] R927 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）15-42-04

[Abstract] Objective To establish an HPLC method to determine the related substance in Vildagliptin. Methods The column was Waters XTerra MS C18 （4.6mm×50mm，3.5μm），the mobile phase A was treated with phosphate buffer-water-acetonitrile-methanol（80：120：3：3），the mobile phase B was treated with phosphate buffer-water-acetonitrile-methanol（8：9：3），which was used as gradient elution.The detection wavelength was 210nm，the flow rate was 1.5mL/min. Results The resolution of vildagliptin and its related substance was above 1.3，detection limit was 1.2～1.6ng， quantification limit was 2.4～3.3ng. Conclusion The method was suitable for the determination of related substance in vildagliptin.

[Key words] HPLC；Vildagliptin；Related substance；Determination

維格列汀（Vildagliptin）是一種口服給藥的Ⅳ型二肽基肽酶（DPP-4）抑制劑，通過與DPP-4 結(jié)合形成DPP-4復(fù)合物而抑制該酶的活性，在提高胰高血糖素樣多肽（GLP）-1 濃度、促使胰島B細胞產(chǎn)生胰島素的同時，可降低胰高血糖素濃度，從而降低血糖，且對體重?zé)o明顯影響[1-7]。根據(jù)維格列汀的合成工藝[8-12]，可能存在的有關(guān)物質(zhì)有維格列汀雙取代雜質(zhì)、維格列汀酰胺、維格列汀環(huán)脒、維格列汀二酮哌嗪等。為了保證藥品的安全性，現(xiàn)對自制的維格列汀原料藥有關(guān)物質(zhì)測定方法進行研究，建立了高效液相色譜法（HPLC）不加校正因子的主成分自身對照法對進行維格列汀雙取代雜質(zhì)限量檢查；采用加校正因子的主成分自身對照法測定維格列汀環(huán)脒、維格列汀酰胺、維格列汀二酮哌嗪，方法簡便、靈敏度高、專屬性強、準(zhǔn)確度高。

1 儀器與試藥

島津LC-2010A HT液相色譜儀，甲醇、乙腈均為色譜純，無水磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鉀、鹽酸

均為分析純，雙蒸水；維格列汀（自制，批號為20141101、20141102、20141201），維格列汀對照品（TLC，批號為1376-008A1），中間體1、中間體2（自制），維格列汀雙取代雜質(zhì)對照品（TLC，批號為1497-003A7），維格列汀酰胺對照品（TLC，批號為1448-001A2），維格列汀環(huán)脒（TLC，批號為1466-010A3），維格列汀二酮哌嗪（TLC，批號為1424-093A3）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[13-14]與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為Waters XTerra MS C18柱（4.6mm× 50mm，3.5μm），以磷酸鹽緩沖液-水-乙腈-甲醇（80：120：3：3）為流動相A，以磷酸鹽緩沖液-乙腈-甲醇（8：9：3）為流動相B，梯度洗脫（0～1.0min，100%A；1.0～3.0min，100%A→90%A；3.0～8.0min，90%A→30%A；8.0～8.1min，30%A→100%A；8.1～11.0min，100%A）；檢測波長為210nm；柱溫35℃；流速1.5mL/min。分別取維格列汀、中間體1、中間體2、維格列汀雙取代雜質(zhì)、維格列汀酰胺、維格列汀環(huán)脒和維格列汀二酮哌嗪對照品各適量，加溶劑[鹽酸溶液（2→1000）-乙腈（90：10）]溶解制成每1mL中約含維格列汀1mg，中間體1、中間體2、維格列汀雙取代雜質(zhì)、維格列汀酰胺、維格列汀環(huán)脒和維格列汀二酮哌嗪各10μg的溶液，搖勻。精密量取10?L，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。理論塔板數(shù)按維格列汀主峰計算為16645，各相鄰峰之間的分離度均>1.3。

2.2 1%對照溶液進樣精密度試驗

精密稱取供試品適量，加溶劑溶解并稀釋制成約含維格列汀10?g/mL的溶液，精密量取10μL注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次測定，結(jié)果色譜峰面積的RSD為0.27%。表明方法的進樣精密度良好。

2.3 專屬性試驗

精密量取供試品約0.2g，置100mL棕色量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得供試品母液。精密量取供試品母液5mL，共5份，分別置10mL量瓶中，按以下條件試驗：一份加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過；一份加0.3%的過氧化氫溶液1mL，搖勻，室溫放置60min，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過；一份加1mol/L鹽酸溶液1mL，搖勻，室溫放置3小時，用1mol/L氫氧化鈉溶液1mL中和，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過；一份加1mol/L氫氧化鈉溶液1mL，搖勻，室溫放置1.5h，用1mol/L鹽酸溶液1mL中和，加溶劑至刻度，搖勻，濾過；一份置100℃水浴2.7h，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過；取本品適量，在光照強度為4500lx±500lx的培養(yǎng)箱照射5d，精密稱取適量，加溶劑溶解并稀釋制成含維格列汀1mg/mL的溶液，搖勻，濾過。分別精密量取上述6種溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。

2.4 檢測限和定量限

分別精密稱取維格列汀、維格列汀酰胺、維格列汀環(huán)脒、維格列汀二酮哌嗪和維格列汀雙取代雜質(zhì)對照品適量，分別加溶劑溶解并稀釋制成每1mL中約含維格列汀、維格列汀酰胺、維格列汀環(huán)脒、維格列汀二酮哌嗪和維格列汀雙取代雜質(zhì)10μg/mL的溶液，搖勻，再逐級稀釋，精密量取10?L注入液相色譜儀，經(jīng)分析，維格列汀的檢測限為1.6ng（S/N≈3）、定量限為3.3ng（S/N≈10），維格列汀酰胺的檢測限為1.4ng（S/N≈3）、定量限為2.8ng（S/N≈10），維格列汀環(huán)脒的檢測限為1.2ng（S/N≈3）、定量限為2.4 ng（S/N≈10），維格列汀二酮哌嗪的檢測限為1.6ng（S/N≈3）、定量限為3.3ng（S/N≈10），維格列汀雙取代雜質(zhì)的檢測限為1.5ng（S/N≈3）、定量限為3.1ng（S/N≈10）。

2.5 線性關(guān)系試驗及校正因子的測定

分別精密稱取維格列汀、維格列汀環(huán)脒、維格列汀酰胺、維格列汀二酮哌嗪及維格列汀雙取代雜質(zhì)對照品適量，分別加溶劑溶解并稀釋成每1mL中約含各組分10μg的溶液，分別精密量取該溶液0.25、0.4、0.5、0.6、0.75mL置5mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度（μg/mL）對峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程、校正因子等結(jié)果見表1。

2.6 回收率試驗

精密稱取維格列汀供試品和維格列汀環(huán)脒、維格列汀酰胺、維格列汀二酮哌嗪及維格列汀雙取代雜質(zhì)對照品，加溶劑溶解并制成供試品中含有各雜質(zhì)濃度為限度的50%、100%及150%溶液各三份，分別取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖并計算各雜質(zhì)的回收率及RSD。維格列汀環(huán)脒回收率為102.99%，RSD=0.88%（n=9）；維格列汀酰胺回收率為102.76%，RSD=1.34%（n=9）；維格列汀二酮哌嗪回收率為100.68%，RSD=1.20%（n=9）；維格列汀雙取代雜質(zhì)回收率為99.95%，RSD=1.38%（n=9）。有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)回收率試驗中各雜質(zhì)平均回收率均在98%～102%，各雜質(zhì)回收率RSD均在2%以下，說明方法準(zhǔn)確度良好。

2.7 重復(fù)性和溶液穩(wěn)定性試驗

取批號為20141101的維格列汀6份，精密稱定，加溶劑溶解并稀釋制每1mL中約含維格列汀1mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1mL，置100mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。分別取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，各已知雜質(zhì)按峰面積乘以校正因子計算，未知雜質(zhì)按不加校正因子的主成分自身對照法計算，結(jié)果維格列汀環(huán)脒、維格列汀酰胺、維格列汀二酮哌嗪均未檢出，維格列汀雙取代雜質(zhì)RSD=1.44%，未知雜質(zhì)RSD=0.00%，總雜質(zhì)RSD=0.81%），表明方法重復(fù)性良好。取其中一份溶液，分別放置0h、1h、2h、4h、8h、10h后測定，結(jié)果各雜質(zhì)峰峰面積的RSD均小于2.0%，表明供試品溶液10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 供試品有關(guān)物質(zhì)檢查

取3批供試品，照2.7項下的方法制備供試品溶液及對照溶液，照2.1項下的色譜條件，分別取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，各已知雜質(zhì)按峰面積乘以校正因子計算，未知雜質(zhì)按不加校正因子的主成分自身對照法計算，見表2。

3 討論

檢測波長的選擇：分別精密稱取維格列汀及各雜質(zhì)對照品適量，加溶劑溶解并稀釋制成每1ml中約含20μg的溶液，照紫外-可見分光光度法，于190～400nm波長范圍內(nèi)掃描，各組分在210nm有均吸收。因此，將本品有關(guān)物質(zhì)的檢測波長確定為210nm。

維格列汀為弱堿性物質(zhì)，若流動相為酸性或中性溶液，其在C18柱上不易洗脫或色譜峰嚴(yán)重拖尾。本文采用pH值為（6.50±0.05）的磷酸鹽緩沖液[取無水磷酸二氫鉀1.3g，置1000mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，用磷酸氫二鉀溶液（取無水磷酸氫二鉀1.5g，加水10mL使溶解）調(diào)節(jié)pH值至6.50±0.05]配制流動相，使藥物以陽離子的形式存在，可以降低藥物的保留值、改善拖尾。

專屬性試驗結(jié)果表明，維格列汀在高溫和強堿破壞中產(chǎn)生維格列汀酰胺，在氧化和高溫中產(chǎn)生維格列汀二酮哌嗪，在高溫中產(chǎn)生維格列汀環(huán)脒，維格列汀雙取代雜質(zhì)在強光、強酸、強堿、氧化及高溫條件下均無明顯變化。通過安捷倫色譜工作站提供的“全波長法”分析以上色譜圖，維格列汀峰純度指數(shù)值均大于0.990，說明主峰均為單一物質(zhì)峰，且降解產(chǎn)物峰、已知雜質(zhì)峰均與主峰的分離度滿足檢測要求，說明本法專屬性良好。

校正因子的測定表明，維格列汀雙取代雜質(zhì)的校正因子沒有超出0.9～1.1的范圍，可直接采用不加校正因子的主成分自身對照法進行限量檢查；維格列汀環(huán)脒、維格列汀酰胺、維格列汀二酮哌嗪的校正因子超出0.9～1.1的范圍，應(yīng)采用加校正因子的主成分自身對照法測定[15-16]，此法無需長期提供雜質(zhì)對照品，同時又考慮到了雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)值不同所引起的誤差，準(zhǔn)確度較好。

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（收稿日期：2017-06-12）