血清MK和Th17/調節性T細胞對類風濕關節炎患者病情發生發展的影響

沈聰　劉嬋娟　孫宇琦

[摘要] 目的 觀察輔助性T 細胞17（Th17）/調節性T細胞（Terg）免疫失衡在來風濕關節炎患者發病時的作用，探討血清中期因子（MK）和Th17/調節性T細胞對類風濕關節炎患者病情發生發展的影響。方法 選取2013年3月～ 2016年1月在我院接受治療的類風濕關節炎患者58例，分為活動組和非活動組，DAS28≤3.2為非活動組，DAS28>3.2為活動組，另將30例健康患者作為對照組，活動組患者32例，非活動組患者26例，采用酶聯免疫吸附法對3組患者的血清MK、白介素-17（IL-17）、白介素-6（IL-6）、白介素-23（IL-23）水平進行檢測，利用流式細胞術檢測調節性T細胞和外周血Th17細胞的比例變化，并對其比例變化和血清MK、IL-17、IL-6、IL-23的水平進行比較。結果 活動組Th17、調節性T細胞比例分別與非活動組相比較差異具有統計學意義（P<0.05），活動組與非活動組的Th17、調節性T細胞比例分別與對照組相比較異具有統計學意義（P<0.05）。活動組與非活動組的IL-17、IL-6和IL-23水平分別與對照組相比較異具有統計學意義（P<0.05）。血清MK與Th17、T細胞的百分比和平衡相關的相關性結果顯示，Th17和Treg均與血清MK無關，P>0.05，而與STAT5成負相關（P<0.05）。結論 類風濕性關節炎患者的血清MK上升，且類風濕性關節炎患者Th17/Terg平衡中Th17相對增高，而Terg會相對降低，MK的上升和Th17/Terg平衡失調都促進了RA的發生發展。

[關鍵詞] MK；Th17；調節性T細胞；類風濕關節炎

[中圖分類號] R593.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）15-107-03

[Abstract] Objective To explore the effect of immune imbalance of T helper cell 17（Th17） and regulatory T cell（Terg） on attack of patients with rheumatoid arthritis and to explore the effect of serum midkine（MK）， Th17 and regulatory T cell on the occurrence and development of patients with rheumatoid arthritis. Methods 58 patients with rheumatoid arthritis who were admitted to our hospital from March 2013 to January 2016 were selected. They were divided into the active group（DAS28>3.2） and the inactive group（DAS28≤3.2）. Other 30 healthy people were selected as the control group. There were 32 cases in the active group and 26 cases in the inactive group. Levels of serum MK， Interleukin-17（IL-17）， Interleukin-6（IL-6） and Interleukin-23（IL-23） were detected by enzyme linked immunosorbent assay. Changes of ratio of regulatory T cell and peripheral blood（Th17） were detected by flow cytometry. In addition， changes of ratio and levels of MK， IL-17， IL-6 and IL-23 were compared. Results Th17 and regulatory T cell ratio in the active group and the inactive group had respectively comparative difference and the difference was statistically significant（P<0.05）. The active group and the inactive group had respectively comparative differences with the control group in Th17 and regulatory T cell ratio and differences were statistically significant（P<0.05）. Levels of IL-17， IL-6 and IL-23 of the active group and the inactive group had respectively comparative differences with the control group and differences were statistically significant（P<0.05）. Percentage of serum MK and Th17， percentage of serum MK and T cell and results of correlation related to balance showed that Th17 and Terg were both had no relation with serum MK， P>0.05 while they were negatively correlated with STAT5（P<0.05）. Conclusion Serum MK of patients with rheumatoid arthritis increases， Th17 in balance of Th17 and Terg relatively increase and Terg relatively decreases. Increase of MK and imbalance of Th17 and Terg both promote the occurrence and development of RA.

[Key words] MK； Th17； Regulatory T cell； Rheumatoid arthritis

類風濕關節炎是一種自身免疫性疾病[1]，目前認為是感染引起遺傳易感個體的A身免疫反應，其病理生理的改變主要由前炎性CD4+的Thl介導[2-3]。類風濕關節炎患者輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）細胞相對升高，而調節性T細胞（Regulatory cell，Terg）則相對下降，Th17/Treg細胞有所偏倚，而導致兩群細胞比例異常的重要因素與白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-23（Interleukin-23，IL-23）和白介素-17（Interleukin-17，IL-17）等相關細胞因子的異常有關[4-5]。 調節性T細胞調節 Th17 細胞分化的重要機制是 RORγt 和Foxp3 平衡被打破，在一定程度上抑制了Th17 細胞的分化。Thl7/Terg平衡相關因子主要包括叉狀頭轉錄因子（Foxp3）、信號傳導與轉錄激活因子（STAT3）、維甲酸相關孤核受體轉錄因子（RORγτ）、STAT5 mRNA[6-7]，本文將探討血清MK和Th17/調節性T細胞對類風濕關節炎患者病情發生發展的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年3月～2016年1月在我院接受治療的類風濕關節炎患者58例，RA患者根據美國風濕學會1987年的RA分類標準及疾病活動度DAS28評分，分為活動組和非活動組，DAS28≤3.2組為非活動組，DAS28>3.2為活動組，另將30例健康患者作為對照組，活動組患者32例，非活動組患者26例，RA患者病程2 ～ 13年，活動組患者男18例，女14例，平均年齡（56±13）歲，非活動組患者男16例，女10例，平均年齡（58±11）歲，健康組男17例，女13例，平均年齡（58±15）歲。三組患者性別、年齡等一般資料比較無統計學差異（P>0.05）。納入標準：（1）健康組人員無相關自身免疫性疾病、腫瘤或近期感染史，且年齡和性別與RA組匹配。（2）近3個月內避免使用免疫抑制劑或激素。排除標準：（1）合并其他風濕性疾?。唬?）合并其他慢性疾病；（3）明顯血液學指標異常。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 奧地利產Sunrise TECAN型酶標，杭州四季清公司產胎牛血清。IL-17、IL-16、IL-23、TGF-B ELISA試劑盒均購自美國R&D公司，KDC-40低速離心機。

1.2.2 檢測方法 檢測細胞因子：首先測定患者血清和關節液，并對對照組血清中的IL-17、IL-23、IL-6水平進行檢測，按照說明書進行操作，使用酶標儀檢測各孔OD值，以空白孔均值調零。檢測Th17：采用流式細胞術進行檢測，用RPMll640稀釋后，再加入25μL PMA、20μL Ionomy-cin，37℃孵育5h左右。設同型對照管（A管）和檢測管（B管），每管分別加入2.5μL CD-PerCP和2.5L CD8-FITC，在避光條件下進行孵育約15min，加入Reagent A，在避光條件下放置約15min。清洗后，兩只試管都加入100μLFix&Penn中的溶血液和破膜。在避光條件下放置約15min后清洗，清洗后加500 μL PBS重懸。流式細胞術檢測Treg：將肝素鈉抗凝全血50μL加入10μLFITC-CD4/APC-CD25。溶血洗滌后棄上清，使用1mL新鮮配置的Fixation/Permmeabilization液混勻，在溫度為4℃條件下進行孵育2h。洗滌后，加入1μL正常鼠血清于4℃避光封閉15min，并加入10μL PE.抗人Foxp3mAb于4℃避光孵育30min，經洗滌后，用500μL染色緩沖液重懸，上機分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 15.0軟件進行數據分析。計數資料以頻數表示，比較采用χ2檢驗；計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組患者Th17和調節性T細胞比例比較

活動組Th17、調節性T細胞比例分別與非活動組相比較差異具有統計學意義，活動組與非活動組的Th17、調節性T細胞比例分別與對照組相比較均具有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 三組患者IL-17、IL-6和IL-23比較

活動組IL-17、IL-6和IL-23水平分別與非活動組相比較差異具有統計學意義（P<0.05），活動組與非活動組的IL-17、IL-6和IL-23水平分別與對照組相比較異具有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 血清中期因子（midkine，MK）與Th17、T細胞的百分比和平衡相關的相關性

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，研究者發現Thl7是能夠分泌IL-17的Th細胞亞群[8-9]。Treg細胞是淋巴細胞中的一個重要組分，它們可通過抑制自身反應性T細胞的功能而發揮免疫調節作用，維持機體的免疫穩定而不至于發生自身免疫病。MK是一種肝素結合生長/分化因子，在腫瘤發生、發展以及預后過程中具有很重要的影響[10-11]。

調控Th17細胞分化的轉錄因子有很多，但最重要的就是RORγτ，這種因子會促進Th17生成，同時，RORγτ得一個關鍵的活化信號就是信號傳導與轉錄激活因子，信號傳導與轉錄激活因子會促進RORγτ的分化，也會促進Th17生成，因此我們通常認為信號傳導與轉錄激活因子是Th17的調節因子[12-13]。本研究中，三組患者Th17和調節性T細胞比例比較結果顯示，活動組Th17、調節性T細胞比例分別與非活動組相比較差異具有統計學意義（P<0.05），活動組與非活動組的Th17、調節性T細胞比例分別與對照組相比較異具有統計學意義（P<0.05），這說明Th17/Treg細胞亞群失衡在RA發病中具有很大影響。目前不少學者的研究已經證明，無論是嚙齒類動物還是人類，IL-6和IL-17都是Thl7細胞生長發育主要的細胞因子[14-15]，本實驗用ELISA法測定RA患者外周血分離血清中IL-6和IL-17的濃度，發現RA患者血清中IL-6和IL-17濃度均高于對照組。同時，本研究還發現，血清MK與Th17和Treg均無相關性，而與STAT5成負相關。

綜上，類風濕關節炎患者的血清MK升高，且類風濕性關節炎患者Th17/Terg平衡中Th17相對增高，而Terg會相對降低，MK的升高和Th17/Terg平衡失調可能共同參與并促進了RA的發生發展。

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（收稿日期：2017-04-13）